Индекс
издания
76063

ISSN 2303-9949

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ «ОКНА ИМПЛАНТАЦИИ» У ПАЦИЕНТОК С НЕУДАЧНЫМИ ПОПЫТКАМИ ЭКО В АНАМНЕЗЕ

Автор: К.А.Яворовская,Т.А.Охтырская,Т.А.Демура, Н.М. Файзуллина,Л.С. Ежова
Место работы: Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И.Кулакова, г. Москва

Резюме: Представлены результаты исследования биоптатов эндометрия 22 женщин с бесплодием и неудачными попытками ЭКО в анамнезе. Использованы гистологические и иммуногистохимические методы исследования.При иммуногистохимическом исследовании эндометрия выявлен высокий уровень белка PAI-1 в поверхностном эпителии эндометрия, что вероятно является причиной нарушения адгезии и инвазии бластоцисты. Выявлена зависимость уровня белка PAI-1 в эндометрии от полиморфизма гена PAI-1.

Ключевые слова:PAI-1, эндометрий, имплантация, неудачи ЭКО.

В последние годы предметом активного обсуждения исследователей становится проблема повышения результативности циклов ЭКО. Несмотря на более чем 30-летнюю историю существования метода, эффективность программ ЭКО за последние годы значительно не меняется /2,4,5/. В случае переноса в полость матки эмбрионов хорошего качества и исключения всех явных причин, препятствующих благополучному завершению программы, неудачу ЭКО расценивают как нарушение на этапе имплантации эмбриона /10,14/. Считается, что в генезе имплантационных потерь важную роль играет нарушение функционирования эндометрия на молекулярно-клеточном уровне/1,14/.В последние годы активно расширяются представления о состоянии эндометрия в короткий период «окна имплантации», соответствующего 21-24 дню менструального цикла; научные исследования направлены на поиск новых объективных маркеров адекватной секреторной трансформации эндометрия и функциональной полноценности «окна имплантации».Наряду с рутинным гистологическим исследованием в практику внедряются молекулярно-генетические методы исследования эндометрия, дополняющие современные представления об имплантации и генезе бесплодия – проводится определение процента клеток поверхностного эпителия с наличием зрелых пиноподий, исследование экспрессиистероидных рецепторов. В научной литературе изучена экспрессия ряда цитокинов (лейкемия-ингибирующий фактор, интегрины), ростовых факторов (колониестимулирующий фактор роста, сосудистый эндотелиальный фактор роста) и др. /1,14/.

Большое внимание исследователей уделяется изучению роли белкаPAI-1 (ингибитор активатора плазминогена 1 типа) в процессах инвазии и миграции клеток /9/.Данный белок синтезируется и секретируется в кровь клетками эндотелия сосудов, а при гистологических исследованиях обнаруживается практически во всех тканях/3,8/. Наряду с регуляцией фибринолиза,PAI-1 участвует в протеолитическом каскаде, вовлеченном в физиологические и патологические процессы инвазии и ремоделирования тканей/6,8,9,16/. В тканях плазмин является ключевым ферментом внеклеточногопротеолиза. Для образования плазмина необходимо связывание урокиназного активатора плазминогена (uPA) с его рецептором (uPAR), чтоспособствует активации участков адгезии на поверхности клеток, внутриклеточномуфосфорилированию, инициирует протеолиз межклеточного матрикса и миграцию клеток. Связывание PAI-1 с uPA подавляет образование плазмина (рис.1).

 

morf-osob-okna-impl-ris1.jpg 

Рис. 1. Механизм протеолиза межклеточного матрикса

 

 Физиологический контрольпротеолиза межклеточного матрикса осуществляется посредством регуляции активации плазминогена на поверхности клеток, что в свою очередь влияет на активность матриксных металлопротеиназ. Локальныйпротеолиз нарушает архитектонику межклеточного матрикса, связь между клетками, опосредованную интегринами, стимулирует ростовые факторы. PAI-1 подавляет uPA-зависимое образование плазмина.uPAR – рецептор урокиназного активатора плазминогена, ECM – межклеточный матрикс, GF – ростовые факторы, MMP – матриксные металлопротеиназы; αβ – субъединицы интегринов/9/.

В эндометрии белок PAI-1 обнаруживается в клетках стромы на протяжении всего цикла; в позднюю секреторную фазу уровень белка максимален и преимущественно определяется в децидуальных клетках подэпителиального слоястромы; отмечается совместная экспрессия PAI-1 и uPA в децидуальных клетках стромы /13,15/.Физиологическое увеличение экспрессии белка PAI-1 клетками стромы эндометрия в секреторную фазу менструального цикла способствует имплантации бластоцисты, ограничивает межклеточныйпротеолизи снижает риск геморрагий в период инвазии трофобласта. При этом чрезмерно высокий уровень белка PAI-1 связывают со снижением глубины инвазии трофобласта и нарушением имплантации /7,11/. В литературе приводятся данные о влиянии полиморфизма гена PAI-1 675 5G/4G на уровень белка PAI-1 в плазме крови и тканях /3,7,11/. Уровень белка PAI-1 в плазме крови у 4G/4Gгомозигот на 30% выше, чем у 5G/5Gгомозигот/3/.

Цель настоящего исследования – оценить экспрессию белка PAI-1 в эндометрии в период «окна имплантации» у пациенток с повторными неудачами программ ЭКО по сравнению с группой здоровых женщин с реализованной репродуктивной функцией.

Материалы и методы исследования:висследование было включено 108 пациенток в возрасте от 24 до 37 лет с трубно-перитонеальным фактором бесплодия и наличием в анамнезе неудачных программ ЭКО. Средний возраст пациенток составил 31,7±3,2 лет.

В исследовании использовали клинические, лабораторные, ультразвуковые, морфологические, иммуногистохимические и генетические методы. При проведении гормонального обследования у всех пациенток был подтвержден нормальный овариальный резерв. Критериями исключения из исследования явились соматические и гинекологические заболевания, влияющие на репродуктивную функцию и рецептивность эндометрия.Все пациентки были обследованы на наличие генетического полиморфизма гена PAI-1675 5G/4Gметодом полимеразной цепной реакции в реальном времени (Real-timePCR) с использованием диагностических наборов компании «ДНК-Технологии» (Россия).Всем пациенткам была проведена аспирационная биопсия эндометрия (инструментом Pipelle) в период «окна имплантации» (овуляция +7 дней). Материал, полученный при Pipelle-биопсии, после промывания физиологическим раствором и фиксации в 10% нейтральном формалине, заливали в парафин, срезы окрашивали гематоксилином и эозином. На основании морфологической структуры эндометрия из основной группы (n=108) было отобрано 22 образца для иммуногистохимического этапа работы. В I группу вошли биоптаты 11 пациенток с 4G/4G и 5G/4GPAI-1 полиморфизмом; во II группу – 11 пациенток с 5G/5Gполиморфизмом гена PAI-1. В качестве группы контроля для иммуногистохимии был исследован эндометрий 11 здоровых женщин с реализованной репродуктивной функцией без гинекологической патологии, обследованных на полиморфизм гена PAI-1 675 5G/4G.Для определения уровня экспрессии белка PAI-1 использовали первичные антителами к PAI-1(Н-135, SantaCruzBiotechnology, USA,arabbitpolyclonalantibody, разведение 1:200). Результаты иммуногистохимической реакции оценивали полуколичественным методом в баллах по общепринятой методике: отсутствие иммуноокрашенных клеток(-) – 0 баллов; менее 5% иммуноокрашенных клеток (±) – 0,5 балла, менее 20% иммуноокрашенных клеток (+) – 2 балла; от 20 до 40% окрашенных клеток (++) – 4 балла; более 40% окрашенных клеток (+++) – 6 баллов. Статистическая обработка данных выполнена на персональном компьютере с помощью электронных таблиц MicrosoftExcel и пакета прикладных программStatisticaforWindowsv. 7.0, StatSoftInc (США).

Результаты исследования и обсуждение: все пациентки, включенные в исследование (n=108), имели в анамнезетак называемые «имплантационные потери», т.е. ненаступление беременности в программе ЭКО при нормальном овариальном ответе на стимуляцию и оплодотворении более 60% ооцитов, отсутствии патологии полости матки и переносе в полость матки в предшествующих программах ЭКО более 4 эмбрионов хорошего качества без эффекта/10/.

Из 108 биоптатов для иммуногистохимическогоисследования были отобраны образцы ткани от 22 пациенток с нормальной морфологической картиной «окна имплантации» – железы извитые с широким просветом, ядра везикулярные, располагались базально, апикальный край клеток неровный с признаками апокринной секреции в просвет желез, есть признаки васкуляризации и отека стромы. Различий между соотношением ранней и средней секреторной фазы цикла у пациенток I группы, II группы и группы контроля выявлено не было (p>0,05). Процент клеток поверхностного эпителия, содержащих на поверхности зрелые пиноподии, у пациенток I и II групп был ниже по сравнению с группой контроля (p>0,05) (табл. 1, рис.2).

Таблица 1. Результаты УЗИ и морфологического исследования эндометрия

morf-osob-okna-impl-tabl1.jpg 

morf-osob-okna-impl-ris2.jpg

Рис.2. Процент клеток поверхностного эпителия с наличием зрелых пиноподий в исследуемых группах

 При иммуногистохимической реакции белок PAI-1 был выявлен в эндотелии сосудов, поверхностном эпителии и в строме эндометрия в виде коричневого окрашивания. Независимо от локализации уровень белка PAI-1 был достоверно выше у пациенток с бесплодием и повторными неудачами ЭКО (I и II группа) по сравнению с группой здоровых рожавших женщин (группа контроля) (p<0,05). При этом во всех трех группах максимальный уровень белка наблюдался в поверхностном эпителии эндометрия и составил 4±1,2 баллов в I группе; 3,4±2,2 баллов во II группе; 0,95± 1,23 баллов в группе контроля (p<0,05). При сравнении уровня белка PAI-1 в эндометрии пациенток I и II группы были установлены статистически значимые отличия. В строме и в эндотелии сосудов уровень белка PAI-1 был достоверно выше у пациенток I группы с наличием 4GаллеляPAI-1 по сравнению с пациентками II группы с 5G/5G полиморфизмом гена PAI-1 (p<0,05). Данные уровня экспрессии белка PAI-1 представлены на рис. 3-4.

 

morf-osob-okna-impl-ris3.jpg

Рис. 3. Экспрессия белка PAI-1 в эндометрии(баллы)

morf-osob-okna-impl-ris4.jpg

Рис. 4. Экспрессия PAI-1 в эндометрии в период «окна имплантации» (ИГХ): а) – I группа, х 100; б) – II группа, х 400; в) – группа контроля, х 400. Максимальный уровень белка определяется в поверхностном эпителии эндометрия в виде коричневого окрашивания.

В литературе приводятся данные о влиянии 4GаллеляPAI-1 на уровень белка PAI-1 в плазме крови и тканях /3,7,11/. При проведении корреляционного анализа мы выявили прямую зависимость между наличием 4GаллеляPAI-1 и уровнем белка PAI-1 в эндометрии. При этом в группе здоровых рожавших женщин (группа контроля) выявлено значимое влияние 4GаллеляPAI-1 на уровень белка PAI-1 в эндометрии.Коэффициент корреляции Спирмена в эндотелии сосудов группы контроля составил 0,84 (p<0,05), в строме – 0,75 (p<0,05), в поверхностном эпителии – 0,85 (p<0,05). В группе пациенток с повторными неудачами программы ЭКО статистически значимая корреляция была выявлена только в строме эндометрия (табл. 3).

Таблица 2. Корреляция (R) между аллелем 4GPAI-1 и уровнем белкаPAI-1 в эндометрии

morf-osob-okna-impl-tabl2.jpg

В литературе представлены ограниченные данные об уровне и локализации белкаPAI-1 в эндометрии/13,15/. По мнению Nordengren и соавт. физиологическое увеличение PAI-1 в секреторную фазу менструального цикла является важным фактором, необходимым для имплантации, которыйограничивает межклеточный протеолиз и снижает риск геморрагий в период инвазиибластоцисты/15/. При этом другие авторы чрезмерно высокий уровень белкаPAI-1 связывают со снижением глубиныинвазии трофобласта и нарушением имплантации/7,11/. В 1996 г. в работе Khamsi и соавт. было показано, что эмбрионы на стадии бластоцисты секретируют активаторы плазминогена, принимая тем самым активное участие в протеолизе межклеточного матрикса на начальных этапах инвазии/12/. Возможно, обнаруженный в нашей работе высокий уровень белка PAI-1 в поверхностном эпителии у пациенток с повторными неэффективными попытками ЭКО, является причинойподавления активаторов плазминогена, секретируемых бластоцистой на этапе адгезии и, вероятнее всего, является не просто фактором риска микротромбообразования и локального гипофибринолиза, но и возможной причиной нарушения взаимодействия бластоцисты и эндометрия на этапе адгезии и начальных стадиях инвазии.

 Таким образом, проведенное исследование показало, что даже при нормальной морфологической структуре эндометрия у пациенток с неудачными попытками ЭКО в анамнезе отмечается достоверное изменение экспрессии белка PAI-1. Полученные данные расширяют современные представления о молекулярных маркерах, характеризующих функциональную готовность эндометрия к имплантации.

The morphologic and functional endometrial implantation window characteristics in women with recurrent ART failure.

K.A.Yavorovskaya, T.A.Okhtyrskaya, T.A. Demura, N.M. Faizullina, L.S. Ezhova

 The paper presents the results of biopsy specimens from 22 women with recurrent ART failure. Histological and immunohistochemical methods have been used. Immunohistochemicalanalysis showed PAI-1 maximum accumulation in the luminal epithelium that may be one of the reasons of embryo adhesion and invasion disturbances. We observed the correlation between PAI-1 gene polymorphism and PAI-1 protein endometrium level.

Key words: PAI-1, endometrium, implantation, ART failure.

ЛИТЕРАТУРА

1.                 Дюжева Е.В. Гормональная подготовка эндометрия у пациенток с неэффективными

попытками ЭКО в анамнезе: дисс. канд. мед.наук. — М. 2010.- С.120.

2.                 Корсак В.С. ВРТ в России. Отчет за 2008 г. Проблемы репродукции, 2010; 6. — С.15-16.

3.                 Панченко Е.А., Добровольский А.Б. Тромбозы в кардиологии. Механизмы развития и

возможности терапии 1999:164-173.

4.                 Судома И.А., Маслий Ю.В. Алгоритм обследования и лечения пациентов с многократными

неудачными программами ВРТ. Казань, Репродуктивныетехнологиисегодняизавтра. 2007. 20-21.

5.                 Andersen AN, Gianaroli L, Felberbaum R, de Mouzon J, Nygren KG 2005Assisted reproductive

technology in Europe, 2001. Results generated from European registers by ESHRE. Hum Reprod 20:1158-1176.

6.                 Bedaiwy M.A. et al. Genetic Polymorphism in the Fibrinolytic System and Endometriosis Obst&

Gyn 2006; V. 108, Iss.1:162-168.

7.                 Buchholz T., Lohse P., Rogenhofer N. et al. Polymorphisms in the ACE and PAI-1 genes are

associated with recurrent spontaneous miscarriages. Hum. Reprod. 2003; V. 18, 11: 2473-2477.

8.                 Bruse CGuan YCarlberg MCarlström K. Basal release of urokinase plasminogen activator,

plasminogen activator inhibitor-1, and soluble plasminogen activator receptor from separated and cultured endometriotic and endometrial stromal and epithelial cells. FertilSteril.2005; 83 (1):1155-60.

9.                 Cynthia E. Wilkins-Port, Freytag J., Higgins S.P. et al. PAI-1: A Multifunctional SERPIN with

Complex Roles in Cell Signaling and Migration Cell Communication Insights.2010; Vol. 3: 1–10.

10.             Fiedler K., Wurfel W. Effectivity of heparin in assisted reproduction. Eur J Med Res 2004;9:207-

214.

 11. Goodman C., Jeyendran R.S., Coulam C.B. P53 tumor suppressor factor, plasminogen activator inhibitor, and vascular endothelial growth factor gene polymorphisms and recurrent implantation failure FertilSteril 2009;V. 92- 2: 494-498.

12. Khamsi F., Armstrong D.T., Zhang X. Expression of urokinase-type plasminogen activator in human preimplantation embryos Mol Hum Reprod 1996;V.2-4: 273-276.

13.Koh S.C.L., Wong P.C., Yuen R., Chua S.E. et al. Concentration of plasminogen activators and inhibitor in the human endometrium at different phases of the menstrual cycle J ReprodFert 1992; 96: 407-413.

14. Margalioth E., Ben-Chetrit A., Gal M., Eldar-Geva T. Investigation and treatment of repeated implantationfailure following IVF-ET Hum. Reprod., 2006; 21(12): 3036-3043.

15. NordengrenJ.,PilkaR.,NoskovaV. et al. Differential localization and expression of urokinase plasminogen activator (uPA), its receptor (uPAR), and its inhibitor (PAI-1) mRNA and protein in endometrial tissue during the menstrual cycle Mol Hum Reprod 2004; 10 (9): 655-663.

16. Ramón L.A., Gilabert–Estellés J.,

Контактное лицо:

Яворовская Ксения Александровна – д.м.н., профессор, ведущий научный сотрудник 1-го гинекологического отделения ФГУ «НЦАГиП им. В.И.Кулакова» Минздравсоцразвития РФ.

Моб. 8(985) 7655149, e-mail: repro21@yandex.ru, 117997 г. Москва, ул. Ак.Опарина, 4

Соавторы:

Охтырская Татьяна Анатольевна – аспирант НЦАГиП им. В.И.Кулакова Минздравсоцразвития,

1-гинекологическое отделение. Тел. 8-903-154-62-34.

Демура Татьяна Александровна – к.м.н., научный сотрудник патологоанатомического отделения ФГУ «НЦАГиП им. В.И.Кулакова» Минздравсоцразвития РФ.

ФайзуллинаНафисаМуноваровна – к.м.н., научный сотрудник патологоанатомического отделения ФГУ «НЦАГиП им. В.И.Кулакова» Минздравсоцразвития РФ.

Ежова Лариса Сергеевна – к.м.н., старший научный сотрудник патологоанатомического отделения ФГУ «НЦАГиП им. В.И.Кулакова» Минздравсоцразвития РФ.

Архив журнала

Облако тегов

Андрология (3) История медицины (4) Лапароскопия (1) МЕТОД АБДОМИНАЛЬНОЙ ДЕКОМПРЕССИИ ПРИ БЕРЕМЕННОСТИ (1) Мифепристон (1) Мозаицизм (1) ПРОЛАПС ТАЗОВЫХ ОРГАНОВ (1) Перговерис (1) Преждевременная недостаточность яичников (1) Прогестины (1) Селективный модулятор рецепторов прогестерона (СМРП) (1) ЭКО (4) агонисты Гонадотропных Рилизинг Гормонов (аГнРГ) (1) бластоцисты хорошего качества (1) вспомогательные репродуктивные технологии (4) гетеротопическая маточная и шеечная беременность (1) гинекология (2) гистероскопия (1) донация ооцитов (1) заместительная гормональная терапия (1) имплантация (1) климактерические расстройства (1) климактерический период (1) клиническая беременность (2) контролированная стимуляция яичников (1) контролируемая стимуляция суперовуляции (1) культивирование эмбрионов (1) менопауза (1) менопаузальный гонадотропин человека (1) минерально – витаминный комплекс Эмфетал (1) миома (1) миома матки (1) обмен опытом (2) окклюзия подвздошных артерий (1) органосохраняющее оперативное лечение (1) перистальтика (1) подготовка эндометрия (1) постменопауза (1) пролапс гениталий (2) трансдермальный натуральный эстроген (1) фармакоэкономический анализ (1) фоликулостимулирующий гормон (1) фоноэнтерография (1) хромосомный мозаицизм (1) энтеро-энтеральный тормозной рефлекс (1)

Реклама