Индекс
издания
76063

ISSN 2303-9949

Репродуктивная медицина как раздел молекулярной медицины

Молекулярная медицина к настоящему времени достигла определенных успехов, определивших основные ее перспективы.  Они связываются с разработками:

— стратегии изучения молекулярно-генетической природы наследственных и условно-наследственных (мультифакториальных) заболеваний;

— молекулярных методов диагностики конкретных болезней;

— подходов к идентификации личности – геномной дактилоскопии;

— экспериментальных и клинических основ генной терапии;

— молекулярных основ предиктиктивной (предсказательной) медицины;

— исследований по фармакогенетике – анализу причин различной чувствительности к лекарственным препаратам и по фармакогеномике – использованию данных геномики для индивидуальной терапии и созданию новых лекарств.

Центральную проблему молекулярной медицины  составляет выявление генов и идентификация мутаций, ответственных  за проявление конкретной патологии.  

Выделение генов и  идентификация  мутаций, ответственных за моногенные заболевания,  объединенных на основании принципа поражения конкретного гена, осуществляется поэтапно и включает:

1) генетическое (хромосомное) картирование гена;

2) молекулярное (физическое) картирование гена;

3) клонирование и секвенирование выявленного гена;

4) идентификацию мутаций, приводящих к заболеванию.

Генетическое картирование гена основано на анализе сцепления между генами. При этом определяется хромосомная принадлежность и взаимное расположение генов относительно друг друга.  Локализация  сцепления генов устанавливается изучением частоты рекомбинации или обмена участками между гомологичными хромосомами (кроссинговера) в мейозе.

Физическое картирование гена – выявление внутри обнаруженных при генетическом картировании участков хромосом транскрибируемых фрагментов, включающих последовательности нуклеотидов искомого гена. Для этого важно определить расположение на хромосомах индексных маркеров – полиморфных, т.е. варьирующих в популяции, но специфичных для каждого индивидуума, участков ДНК. К ним относятся полиморфные сайты рестрикции, однонуклеотидные замены (SNP) и гипервариабильные  мини- и микросателлитные фрагменты ДНК.

Клонирование и секвенирование генов начинается с получения фрагментов ДНК с помощью рестриктаз, относящихся к группе бактериальных эндонуклеаз. В генетике человека используют несколько десятков различных рестриктаз. Каждый из них  разрывает двуцепочечную ДНК в пределах строго определенных последовательностей нуклеотидов, состоящих из 4-6 пар оснований. Это сверхмалое количество генетического материала размножается (амплифицируется) использованием ПЦР в миллионы раз за несколько часов. Амплификаты используются далее для установления характера мутаций.

Идентификацию мутаций, приводящих к заболеванию, осуществляют с применением различных методов мутационного скрининга. Среди них можно назвать:

1) метод анализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНК – SSCP (Orita e.a., 1989; Glavac, Lean, 1993);

2) денатурирующий градиентный гель-электрофорез – DGGE (Майерс и др., 1990; Fodde, Losekoot, 1994);

3) метод гетеродуплексного анализа – HA (Edwards e.a., 2001);

4) метод химического расщепления некомплементарных сайтов – СМС (Weller, Gartner, 2001);

5) анализ перестроек ДНК-блотингом по Саузерну;

6) химическое обнаружение неспаренных нуклеотидов (ССМ) или метод тестирования неполноценного белка – РТТ.

И, наконец, любые типы мутаций можно обнаружить путем прямого секвенирования мутантной ДНК или отдельных экзонов. Метод удобен для первичного поиска нарушений в кодирующих областях гена.

Однако, для окончательной идентификации мутаций требуются точные доказательства роли найденного гена в возникновении того или иного заболевания. Необходимо установить:

1) отличия нуклеотидной последовательности гена-кандидата больных от таковой здоровых. Это можно обнаружить при секвенировании геномной последовательности;

2) экспрессируемость выделенного гена  в тканях или органах соответствующих больных;

3) возможность  коррекции патологического процесса введением экспрессирующихся  кДНК изучаемого гена в мутантные клетки или организм животного, способного служить биологической моделью наследственных заболеваний.

С учетом всех этих требований и широко используя EST (копии кДНК функционально активных участков генов человека, сохраняющихся в специальных клонотеках) в качестве маркеров, к настоящему времени идентифицировано 320 генов наиболее частых и 170 редких наследственных заболеваний. Предполагается, что в течение ближайшего десятилетия будут описаны гены всех, более или менее часто встречающихся, моногенных болезней. Однако может возникать вопрос о численном несоответствии генов и генетически обусловленных заболеваний. При известном количестве выявленных генов (35 000 — 40 000), не говоря даже о неограниченных возможностях мутирования каждого из них, число наследственных заболеваний не превышает 3500-4000. Это соотношение, по мнению ведущих генетиков (Фогель, Матульский, 1989; Бочков, 1997; Collins, McKusick, 2001; Гинтер, 2001),  поддерживается рядом обстоятельств:

1) многие генные и хромосомные мутации могут проявляться еще в антенатальном, даже в раннем постимплантационном периоде развития плода и приводят к эмбриональной гибели, элиминируя, тем самым, эти мутации из популяции человека еще до рождения;

2) действием принципа эквифинальности, связанного  с  тем, что ограниченное число метаболических процессов и основных функций органов и систем контролируются сотнями  различных генов, т.е. генными ансамблями или сетями. Мутации в отдельных звеньях этой сети приводят к нарушению одного и того же процесса морфогенеза.

3) генетической гетерогенностью многих наследственных заболеваний, т.е. тем, что причиной одних болезней могут быть мутации одного гена, других, напротив, разных генов, включая влияние генов – модификаторов, особенно генов системы детоксикации. Например, мутация только в гене CFTR вызывает не только тяжелое наследственное заболевание муковисцидоз с признаками поражения поджелудочной железы и без него, но и нарушения сперматогенеза или их сочетаний, а мутация в гене дистрофина приводит как к тяжелым формам миодистрофии Дюшена, так и более мягким, вяло текущим формам миодистрофии Беккера. В тоже время болезнь Альцгеймера может быть результатом мутаций и в гене амилоида (Ad), и в пресенелиновых генах PS-1 и PS-2.

В таких случаях необходим последовательный  молекулярный анализ каждого из генов-кандидатов, для того, чтобы выявить наиболее частые, или мажорные, мутации, типичные для конкретной патологии, так как, несмотря на общие принципы закономерностей мутационного процесса, спектры повреждений каждого гена уникальны и соответствуют особенностям первичной его структуры. Особо значимы:

1) обогащенность гена CG-нуклеотидами, что предрасполагает к точечным мутациям типа замены цитозина на тимин;

2) размеры гена;

3) наличие в его структуре прямых и обращенных повторов;

4) присутствие внутри гена последовательностей, гомологичных внегенным участкам, что может приводить к нарушениям процессов рекомбинации в мейозе и т.д.;

5) инсерция мобильных элементов генома (Alu-последовательности, LINE, SINE);

6) возможности динамических мутаций гена, связанных с экспоненциальным ростом числа транскрибируемых (смысловых) или нетранскрибируемых триплетных повторов (Баранов и др., 2005).

Исходя из этих особенностей, моногенные заболевания подразделяются на следующие группы:

1. Болезни, вызванные точечными мутациями, расположенными  по  всей первичной последовательности гена, т.е. без  выраженных мажорных мутаций.

2. Болезни, имеющие характерные мажорные мутации.

3. Болезни, обусловленные крупными делециями.

4. Болезни, связанные с конверсией генов и наличием псевдогенов.

5. Болезни экспансии повторов ДНК (Баранов и др., 2005).

Эти заболевания имеют как общие клинические проявления (умственная отсталость, психические нарушения), так и специфические для каждого конкретного вида (макроорхизм, черепно-лицевой дисморфизм, задержка интеллектуального развития, аутизм, атаксия, ослабление рефлексов, кардиомиопатия, эндокринные расстройства, гипотония, эпилептические приступы и др.). К особенностям данной группы болезней относится утяжеление течения заболеваний в связи с возрастом, передачей от поколения к поколению в пределах одной родословной (антиципация) и увеличением числа накапливающихся повторов.

Выделение генов и идентификация мутаций, участвующих в возникновении мультифакториальных заболеваний имеет свои сложности. Наследование этих, т.е. сложнонаследуемых и соматических болезней смешанного этиопатогенеза (атеросклероз, гипертония, различные  формы рака,  диабет, бронхиальная астма, ревматоидный артрит, старение, нарушение репродуктивной системы и др.), в отличие от традиционных моногенных заболеваний,  не следуют менделевскому принципу. Патогенез таких болезней определяют как генетические, так и экзогенные (эпигенетические) факторы, что вносит существенные затруднения в идентификацию генов. Это требует необходимости предварительных генетико-эпидемиологических исследований на популяционном и семейном уровнях с выявлением уровня повышения показателя относительного риска. Необходимо обращать внимание и на однородность клинического фенотипа, ранний возраст проявления болезни, семейное накопление заболевания, принадлежность к редким этническим группам, для которых  характерна относительно большая аллельная гомогенность.  

Тем не менее, к настоящему времени начаты попытки идентификации генов, ответственных и за эту группу заболеваний. Сложности выявления и идентификации мутаций генов, участвующих в мультифакториальных заболеваниях связаны с рядом особенностей их патогенеза. Это:  1) полигения, т.е. участие нескольких генов в выражении одного  фенотипа, характерной, например, для сахарного диабета, артериальной гипертонии, пигментного ретинита и др.; 2) генетическая гетерогенность, когда одна и та же картина может быть вызвана мутациями различных генетических локусов (но не аллелей). Например, мутации, нарушающие функцию любой цепочки метаболической активации; 3) неполная пенетрантность, т.е. проявление мутантного гена в зависимости от генетического фона или таких причин, как возраст или окружающая среда; 4) наличие фенокопий, когда нормальный генотип может проявлять мутантный фенотип; 5)  неменделевские механизмы передачи, т.е. митохондриальное наследование, экспансия нуклеотидных повторов, явление геномного импринтинга и др.; 6) высокая частота в популяции аллеля, связанного с болезнью, т.е. присутствие в родословной нескольких копий одного и того же аллеля, но разного происхождения.

Единой классификации мультифакториальных заболеваний в доступной литературе нет; в одних случаях они объединены по принципу нозологических форм (сердечно-сосудистые, бронхо-легочные, нейрогенные, эндокринные и др.), в других – по природе наследования (митохондриальное наследование, экспансия  последовательностей). Огромное внимание исследователей привлекает молекулярная природа диабета типа 1 (СД-1), самого известного МФЗ. Анализ информации, накопленной к настоящему времени, указывает, что генетическая предрасположенность к СД-1 связана с наследованием аллелей обычных «здоровых» генов, действующих, при этом, лишь в определенной комбинации. В такой ассоциации могут участвовать как слабо изученные, так и совершенно неизученные генетические факторы. Изучением ассоциации полиморфных генов кандидатов удалось надежно идентифицировать два локуса, связанных с предрасположенностью к развитию СД-1 – MNC (главный комплекс гистосовместимости), расположенный на хромосоме 6 (6p21.3), и полиморфный тандемный повтор (VNTR) 5′-нетранскрибируемой области гена инсулина (INS) – на хромосоме 11 (11p15.5).

Особое место среди мультифакториальных болезней занимают онкозаболевания, отличающиеся многоступенчатостью процесса канцерогенеза, состоящего, по крайней мере, из трех стадий – инициации, промоции и прогрессии. Нарушение генетического гомеостаза клеток может происходить на каждом из этих этапов. Ключевую роль в возникновении опухолей играют повреждения ДНК, о чем свидетельствуют: высокая частота хромосомных перестроек и генных мутаций в клетках ткани больных и в опухолевых клетках, культивируемых in vitro; существование наследственных форм рака; практически полное совпадение классов биогенных (вирусы), химических и физических факторов, обладающих одновременно мутагенными и канцерогенными свойствами.

Мутации, определяющие развитие опухоли, могут быть герминативными или соматическими. Первые существуют уже в гамете, и поэтому присутствуют во всех клетках организма, а вторые формируются в соматических клетках как результат спонтанных или индуцированных мутаций, происходящих в протоонкогенах или различных антионкогенах. На сегодня известно около 100 протоонкогенов и  более 150 антионкогенов, участвующих в формировании опухолей. Доминантные мутации в протоонкогенах возникают либо в результате интеграции онкогенного ретровируса в ДНК (инсерционный мутагенез), либо воздействия мутагенов-канцерогенов. Мутантные гены продуцируют аномальные, более агрессивные белки,  умеющие передавать постоянные сигналы к делению клеток, что может приводить к неконтролируемому росту. Такого рода белки возникают и при усиленной амплификации специфических протоонкогенов, связанных с изменением характера экспрессии генов, а именно,  гипер- или эктопической экспрессии.

Таким образом, нарушение равновесия между позитивной (протоонкогенами) и негативной (антионкогенами) регуляциями деления клеток служит одной из главных причин возникновения опухолей. Следует, однако, заметить, что для окончательного их формирования необходимо комплексное повреждение генов, контролирующих не только пролиферацию, но и дифференциацию, морфогенетические реакции и апоптоз. Это приводит к созданию нестабильности генома клетки, являющейся генетической основой канцерогенеза, проявляемой как на хромосомном, так и генном уровнях (Киселев и др., 2004, Брага и др., 2004).

К ряду мультифакториальных патологий следует относить и нарушения репродуктивной функции, в развитии которых участвуют многие факторы (гормональные, инфекционные, механические, генетические и др.). В последние годы весьма активно изучается  как взаимодействие  этих факторов, так и роль каждого из них в отдельности. Успехи, достигнутые в  такого рода  исследованиях, утверждают особую значимость генетической обусловленности нарушений репродуктивной функции. Так, результаты молекулярно-генетических исследований Y-хромосомы представили убедительные свидетельства о высокой функциональной специализации его длинного плеча, где локализован так называемый AZF локус. Обнаружен целый ряд микроделеций этого региона. Доказано, что те из них, которые отнесены к трем субрегионам (AZFa, AZFb, AZFc) служат причиной нарушения сперматогенеза и приводят, тем самым, к мужскому бесплодию. Некоторые виды микроделеций влияют на различные биологические процессы, например, на частоту нерасхождения половых хромосом в мужских половых клетках и клетках эмбрионов. Выявление  микроделеций Y-хромосомы важно при выборе пациентов для проведения ЭКО или ИКСИ и прогнозирования риска рождения детей с нарушениями репродуктивной функции. Оно поможет также избежать необоснованного лечения мужчин от бесплодия. Следует заметить, что накоплена   весьма внушительная информация по изучению роли AZF-фактора, которая могла бы служить темой отдельного обзора.

К числу частых причин нарушения репродуктивной функции не только мужчин, но и женщин, являются мутации гена CFTR – cystic fibrosis transmembrane regulator   gene (Claustres, 2005).  Они вызывают целый ряд патологических состояний, называемых «CFTR-патии», наиболее известной формой которых является муковисцидоз – аутосомно-рецессивное наследственное заболевание с распространенным поражением экзокринных желез, кистозное поражение которых ведет к повышению вязкости их секретов и последующей закупорке протоков. Поражения репродуктивной системы выражается у мужчин врожденным односторонним или двусторонним нарушением проходимости семявыводящих путей, у женщин – высокой  вязкостью секрета влагалища с нарушением функции маточных труб и ановуляторным циклом. В плане изучения роли CFTR мутаций в репродуктивной патологии также накоплено достаточно информации, требующей специального анализа.

Можно встретить полезную информацию по изучению генетического вклада полиморфизма других генов в развитие эндометриоза, привычного невынашивания беременности, онкологических заболеваний репродуктивной системы. Проводятся попытки выявления ранних генетических маркеров риска развития репродуктивной патологии, важных для оценки индивидуальной предрасположенности к ней и организации профилактики осложнений. Имеются сообщения, что в таком качестве могут обсуждаться полиморфизмы генов ферментов микросомальной монооксидазной системы и антиоксидазной защиты, в частности, – выявление у женщин мутантного аллеля  val гена CYP1A1 и гомозиготного по мутации val/val гена GSTP1.

В предмет репродуктивной медицины входит также разработка основ профилактики многих наследственных болезней. Проблема изначально имеет генетическую направленность и решается с соблюдением пошагового принципа. Мероприятия по такой профилактике начинаются с генетического консультирования супружеских пар и рекомендации признания: оптимального репродуктивного возраста; отказа от деторождения в случаях высокого риска наследственной и врожденной патологии и в браках с кровными родственниками, а также между двумя гетерозиготными носителями патологического гена; исключения содержания мутагенов и тератогенов в среде их обитания и целесообразности прерывания беременности при высокой вероятности заболевания плода или пренатально диагностированной его болезни.

Следующим шагом профилактики наследственной патологии является коррекция проявления патологических генотипов путем управления экспрессией генов, элиминацией эмбрионов и плодов с наследственной патологией, генной инженерией на уровне зародышевых клеток, что теоретически можно осуществлять на разных уровнях онтогенеза (Бочков, 2006). Проведение этих процедур основывается на результатах пренатальной диагностики, осуществляемой тремя методами –  просеивающим (медико-генетическое консультирование), неинвазивным (УЗИ) и инвазивным (хорион- и плацентобиопсия, биопсия тканей плода, анализ амниотической жидкости и крови плода).

Таким образом, к настоящему времени методы профилактики и ранней диагностики наследственных патологий переплелись, более того, – они получили дальнейшее развитие. Появилась возможность еще более ранней диагностики и профилактики наследственных болезней, а именно – предимплантационной. При этом, для диагностики генетических нарушений используются зародыши ранней стадии развития, полученные оплодотворением in vitro яйцеклеток, высвобожденных путем нехирургического лаважа. Это возможно благодаря наличию диагностических микрометодов, чувствительных на уровне одной или нескольких клеток и методов микробиопсии для взятия минимального числа клеток без повреждения зародышевого пузырька. В матку имплантируются лишь зиготы, развитые до стадии бластоцисты и свободные от повреждений, где дальнейшее развитие эмбриона и плода происходит нормально. Следовательно, предимплантационная  диагностика относится не только к методам первичной профилактики наследственных заболеваний, но и профилактического лечения, она исключает вынужденные аборты после пренатальной диагностики в семьях с высоким риском  наследственной патологии.

В заключение следует особо подчеркнуть, что приведенный обзор не претендует на абсолютную полноту охвата всех достижений репродуктивной медицины. Он был задуман для того, чтобы еще раз подчеркнуть особую интенсивность развития этой относительно молодой науки, сопряженность такого характера развития с широким внедрением современных подходов и методов анализа многих наук, особенно общей и молекулярной биологии, генетики и биотехнологии. Эти обстоятельства определяют место репродуктивной медицины в современной медицинской науке, призванной стать молекулярной. Отрадно, что уровень ее развития в Казахстане достаточно высок.

ЛИТЕРАТУРА:

  1. Баранов В. С. и др.  // В кн: Геномика – медицине, 2005 г., с. 361-385
  2. Бочков Н. П. Клиническая генетика, М., 2006 г., 480 с.
  3. Брага Э. А. и др.  // Мол. биол., 2004 г., т.38, №2, с. 179-190
  4. Гинтер Е. К. // Вестник РАМН, 2001 г., №10, с. 25-31
  5. Майерс Р. и др. // Анализ генома. Методы, Мир, 1990 г., с. 123-175
  6. Фогель Ф., Матульски А. Генетика человека, М., Мир, 1989 г., т.1, 308 с.
  7. Edwards S. M. e.a. // Hum. Mut., 2001, v.17, p. 220-232
  8. Fodde R., Losekoot M. // Hum. Mutat., 1994, v.3, №2, p. 83-94
  9. Gauguier D. e.a. // Nature Genet., 1996, v.12, p. 38-43
  10. Glavac D., Dean M. // Hum. Mutat., 1993, v.2, №5, p. 404-414
  11. Goltsov A. A. e.a. // Am. J. Hum. Genet., 1992, v.51, p. 627-636
  12. Hacia J. G. e.a. // Mol. Psychiatry, 1998, v.3, №6, p. 483-492
  13. Hamer D. N. e.a. // Science, 1993, v.261, p. 321-327
  14. Hastedt S. J. e.a. // Am. J. Hum. Genet., 1994, v.55, p. 738-746
  15. Hertz J. M. e.a. // Hum. Mutat., 2001, v.18, №2, p. 141-148
  16. Ivaschenko T. e.a. // J. Mol. Med., 2002, v.80, p. 39-43
  17. Jeunemaitre X. e.a. // Nature Genet., 1993, №1, p. 72-75
  18. Landegren U. N. // BioAssays, 1993, v.15, №11, p. 761-765
  19. Larson N. G. e.a.  // Am. J. Hum. Genet., 1992, v.50, p. 360-363
  20. Lin D. e.a. // Hum.Mutat., 2001, v.18, p. 42-51
  21. Macleod K.  // Cur. opin. in genet and devel., 2000, v.10, p. 81-93
  22. Macville M.  e.a.  // Cancer Res., 1999, v.59, p. 141-150
  23. Matsuo T. e.a.  // Tromb. Res., 1992, №65, p. 495-505
  24. Mein C. A. e.a.  // Nat. Genet., 1998, v.19, №3, p. 297-300
  25. Mostanchinolo M. L. e.a. // Hum. Mutat., 2001, v.18, p. 32-41
  26. Muminov T. A., Beisembayeva Sh. A., Amireev S. A. e.a. //  International Journal of Tuberculosis and Lung Disease, v.9,11, 2005, sup.1, p. S101
  27. Mutch M. G. e.a. // Hum. Mutat., 1999, v.13, p. 175-186
  28. Neumann P. E. e.a. // Nature Genet., 1994, v.6, p. 357-362
  29. Newton C. R. e.a. // Lancet, 1989, v.30, p. 1481-1482
  30. Ngo I. S. L. e.a. // Hum. Genet., 1991, v.87, p. 613-617
  31. Nichols R. D., Knepper J. L.  // Ann. Rev. Genomics Hum. Genet., 2001, v.15, p. 153-175
  32. Nishina P. M.  e.a.  // PNAS, USA, 1992, №89, p. 708-712
  33. Orita M. e.a. // PNAS, USA, 1989, v.86, p. 2766-2770

Облако тегов

Андрология (3) История медицины (4) Лапароскопия (1) МЕТОД АБДОМИНАЛЬНОЙ ДЕКОМПРЕССИИ ПРИ БЕРЕМЕННОСТИ (1) Мифепристон (1) Мозаицизм (1) ПРОЛАПС ТАЗОВЫХ ОРГАНОВ (1) Перговерис (1) Преждевременная недостаточность яичников (1) Прогестины (1) Селективный модулятор рецепторов прогестерона (СМРП) (1) ЭКО (4) агонисты Гонадотропных Рилизинг Гормонов (аГнРГ) (1) бластоцисты хорошего качества (1) вспомогательные репродуктивные технологии (4) гетеротопическая маточная и шеечная беременность (1) гинекология (2) гистероскопия (1) донация ооцитов (1) заместительная гормональная терапия (1) имплантация (1) климактерические расстройства (1) климактерический период (1) клиническая беременность (2) контролированная стимуляция яичников (1) контролируемая стимуляция суперовуляции (1) культивирование эмбрионов (1) менопауза (1) менопаузальный гонадотропин человека (1) минерально – витаминный комплекс Эмфетал (1) миома (1) миома матки (1) обмен опытом (2) окклюзия подвздошных артерий (1) органосохраняющее оперативное лечение (1) перистальтика (1) подготовка эндометрия (1) постменопауза (1) пролапс гениталий (2) трансдермальный натуральный эстроген (1) фармакоэкономический анализ (1) фоликулостимулирующий гормон (1) фоноэнтерография (1) хромосомный мозаицизм (1) энтеро-энтеральный тормозной рефлекс (1)

Реклама