ГЛАВНАЯ ЖУРНАЛЫ СОБЫТИЯ ИЗДАНИЯ КОНГРЕСС О НАС КОНТАКТЫ  

Исследование качественных показателей ооцитов человека, как критерия успешной реализации витрификации в программах вспомогательных репродуктивных технологий
 
С. Б. Байкошкарова, М. К. Отарбаев, Н. Г. Рахметова
Клиника репродукции человека «Экомед»,
Казахстан, Алматы


Аннотация

В настоящее время основной задачей репродуктологии является рациональное использование человеческих гамет и эмбрионов. В программах ВРТ часто можно наблюдать появление ооцитов с различными повреждениями. Эти повреждения ооцитов можно условно разделить на две группы: экстрацитоплазматические и интрацитоплазматические. К экстрацитоплазматическим патологиям относят нарушение строения и формы зоны пеллюцида, дебрис в перивителлиновом пространстве и его резкое увеличение, аномалии первого полярного тела (увеличение в размере, дегенерация, мультифрагментация), а также нарушение симметрии оолеммы ооцита. К интрацитоплазматическим аномалиям ооцита относят гранулярность цитоплазмы клетки, агрегаты гладкого эндоплазматического ретикулума, рефрактерные тела, вакуоли, нарушение вязкости цитоплазмы. В статье рассматриваются критерии оценки качества ооцитов в криоциклах, а также прогноз успешной реализации криоконсервации методом витрификации в зависимости от качественных показателей клеток.

Ключевые слова: вспомогательные репродуктивные технологии, витрификация, качество ооцитов, дисморфизмы, экстракорпоральное оплодотворение.

В настоящее время основной задачей репродуктологии является рациональное использование человеческих гамет и эмбрионов в программах вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). Целенаправленно эту проблему можно преодолеть двумя путями. Первое - ограничить выход биоматериала, используя мягкие/минимальные протоколы стимуляции суперовуляции или обходясь без стимуляции в натуральных циклах, где выход гамет является минимальным, соответственно эмбрионов тоже.

Однако этот путь имеет свои недостатки (сравнительно более низкая результативность, селективный отбор пациентов, недостаточность биоматериала в программах предимплантационной генетической диагностики, несовершенство индивидуализации протоколов и др.). В этой связи в последние десятилетия бурно начали развиваться технологии криоконсервации гамет и эмбрионов [1,2]. Прогрессивное развитие этой области криобиологии привело к появлению методов витрификации. С помощью витрификации удалось добиться успешной заморозки и разморозки, таких «капризных», хрупких объектов, как человеческие ооциты. Так в феврале 1997 г. Итальянская клиника сообщила о рождении здоровой девочки после интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ) в замороженный и размороженный ооцит [3,4].

Технология криоконсервации дает не только возможность рационального использования биоматериала, но и в случае витрификации ооцитов открывает перспективу сохранения репродуктивного потенциала на неопределенный промежуток времени, при риске утраты овариальной функции, как в случае злокачественных новообразований, так и в силу определенных социальных причин [5,6]. Однако она имеет свои ограничения ввиду того, что успешность реализации витрификации зависит от качественных показателей ооцитов [7]. Качество ооцита является важным прогностическим фактором, так как ядерная и цитоплазматическая зрелость клетки напрямую связаны с эффективностью не только витрификации, но и в целом программ ВРТ [8].

Ооцит человека с «идеальными» параметрами имеет светлую умеренно гранулярную цитоплазму, небольшое перивителлиновое пространство, интактное первое полярное тело, круглую и бесцветную зону пеллюцида (ZP). Все, встречающиеся в клинической практике, аномалии ооцита можно условно разделить на две группы: экстрацитоплазматические и цитоплазматические. К экстрацитоплазматическим аномалиям относят нарушение строения и формы зоны пеллюцида, дебрис в перивителлиновом пространстве и его резкое увеличение, аномалии первого полярного тела (увеличение в размере, дегенерация, мультифрагментация), а также нарушение симметрии оолеммы ооцита.

К интрацитоплазматическим аномалиям, определяемым на световом уровне при оценке ооцита, относят гранулярность цитоплазмы клетки, агрегаты ГЭР, рефрактерные тела, вакуоли, нарушение вязкости цитоплазмы [8-14].
Основываясь на вышеизложенном, целью наших исследований было изучение влияния морфологических показателей ооцитов человека на успешную выживаемость и частоту оплодотворения в циклах криоконсерваций ооцитов путем витрификации.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Описанные в данной статье исследования были проведены в частном медицинском центре (Экомед г. Алматы, Казахстан). Все участвующие пары подписали письменное информированное согласие на криоконсервацию и культивирование яйцеклеток и эмбрионов.

Исследование качественных показателей ооцитов человека, как критерия успешной реализации витрификации в программах вспомогательных репродуктивных технологий


Нами был проведен ретроспективный анализ 60 циклов криоконсервации ооцитов у 60 супружеских пар прошедших различные программы ВРТ в период 2011-2012 года. Возраст женщин варьировался в пределах от 22 до 38 лет. Стимуляцию суперовуляции у женщин проводили по схеме гонадотропинами, контролировали развитие фолликулов с помощью ультразвукового исследования. При достижении доминантными фолликулами размера 18-20 мм вводили триггер овуляции – хорионический гонадотропин (ХГ) в дозе 5-10 тыс.МЕ. Преовуляторные ооциты получали посредством трансвагинальной пункции фолликулов через 35-36 часов после инъекции ХГ.

Оценка морфологических показателей ооцитов производилась через 3,5-4,0 часа после трансвагинальной пункции, путем энзиматического очищения в растворе гиалуронидазы ооцит/кумулюсных комплексов По выявленным морфологическим аномалиям ооциты были резделены на следующие группы и подгруппы:

I. Морфологически нормальные ооциты;

II. Экстрацитоплазматические аномалии:
1. Ооциты с аномалиями формы (аномалии зоны пеллюцида, аномалии периветелинового пространства);
2. Ооциты с аномалиями полярных телец;
3. Ооциты с дебрисом.

III. Интрацитоплазматические аномалии:
1. Ооциты с вакуолизацией;
2. Ооциты с гранулированной и окрашенной цитоплазмой;
3. Ооциты с агрегацией ЭР и рефрактерными телами.

Исследование качественных показателей ооцитов человека, как критерия успешной реализации витрификации в программах вспомогательных репродуктивных технологий


IV. Смешанные аномалии (экстрацитоплазматические и интрацитоплазматические).
Витрификация и размораживание ооцитов производилась по технологии доктора М. Куваямы с использованием растворов фирмы CryoTech.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ


Ооциты человека особенно чувствительны к повреждениям при замораживании и размораживании вследствие их размеров (самая большая клетка человеческого тела), сложного строения и особенностей клеточного цикла (незавершенный мейоз).

В практике эмбриолога оценить полученные ооциты затруднительно и возможно лишь после энзиматического удаления клеток кумулюса и corona radiata. На световом уровне (максимальное увеличение 400) по выбросу первого полярного тела определяют мейотическое состояние ооцитов (GV, MI, MII), а также можно различить некоторые цитоплазматические аномалии – гранулярность цитоплазмы, вакуолизацию, агрегацию гладкого эндоплазматического ретикулума (ЭР), рефрактерные тела.

Каждая из таких аномалий по-своему влияет на выживаемость ооцитов в криоциклах. Технология витрификации доктора М.Куваямы [15], является успешно используемой и наиболее бережной по отношению к ооцитам, однако, она тоже имеет свои ограничения зависимые от качества гамет до замораживания, которые определенным образом влияют на их криотолерантность и интактность внутриклеточных структур после размораживания.

В таблице 1 приведены общие данные наших исследований. Количество и соотношение зрелых, незрелых и дегенеративных ооцитов было нормальным, а значит все манипуляции направленные на получение ооцитов (гормональная стимуляция, аспирация фолликулов, поиск ооцитов) в циклах ВРТ проводились правильно.

Считается, что нужно замораживать только зрелые ооциты на стадии МII. Однако, мы замораживали и ооциты на стадии МI. Частота выживаемости ооцитов составила 96%, при этом, как и ожидалось зрелые ооциты лучше поддавались витрификации, чем незрелые. Но даже при этом из 16 незрелых ооцитов на стадии МI выжило 9 и к нашему удивлению 4 из них самостоятельно дозрели до стадии МII после размораживания, что указывает на сохранность такой хрупкой структуры как веретено деления ооцитов.

Морфологическая оценка проводилась только у зрелых ооцитов. Результаты выявленных морфологических аномалий показаны на рисунке 1. Как видно на рисунке 1, частота ооцитов с нормальной морфологией составила 45%.

В проведенных нами исследованиях среди ооцитов с аномальной морфологией встречались интрацитоплазматические аномалии 15%, с небольшой разницей экстрацитоплазматические аномалии 13% и сочетанная патология была выявлена у 27%. Эти данные показывают, что каждый второй ооцит имеел какую-либо аномалию. Эти изменения мы отнесли к специфическим аномалиям ооцитов в силу их периодических появлений у различных женщин, разного возраста и региона проживания.

Среди дисморфизмов ооцитов, объеденненных в группу экстрацитоплазматических аномалий, были отмечены: ооциты с аномалиями формы, ооциты с аномалиями полярных телец и ооциты с дебрисом. А в группе интрацитоплазматических аномалий ооцитов были отмечены: ооциты с вакуолизацией, ооциты с гранулированной и окрашенной цитоплазмой, а также ооциты с агрегацией ЭР и рефрактерными телами. Частота встречаемости этих аномалий показаны на рисунке 2.

Исследование качественных показателей ооцитов человека, как критерия успешной реализации витрификации в программах вспомогательных репродуктивных технологий


ля удобства расчетов распределение дисморфизмов сделали в сумме общей встречаемости той или иной группы аномалий. Как видно из рисунка 2 в группе экстрацитоплазматических аномалий распределение дисморфизмов было сравнительно одинаковым в отличие от группы интрацитоплазматических аномалий, где преобладали ооциты с гранулированной цитоплазмой.

Это очень интересное явление, если брать во внимание, что в группе смешанных аномалий частота ооцитов с гранулированной цитоплазмой практически была равна нулю (0,41%), а остальные нарушения встречались в привычных пределах. Возможно, появление этого дисморфизма у ооцитов блокирует появление других морфологических отклонений, либо в сочетании с другими аномалиями оно приводит к наиболее серьезным повреждением клеток, которое заставляет ооциты дегенерировать в процессе оогенеза и в результате их элиминации общая частота ооцитов с гранулированной цитоплазмой снижается в группе смешанных аномалий.

Итоговым критерием наших исследований было сопоставление морфологических характеристик ооцитов с частотой выживаемости после криоконсервации и нормальным оплодотворением после процедуры ИКСИ.

На рисунке 3 показана частота выживаемости ооцитов после криоконсервации и размораживания. Видна положительная корреляция между морфологическими показателями ооцитов и их криотолерантностью. Чем лучше морфология ооцитов, тем лучше их выживаемость после криоконсерваций. Различные дисморфизмы ооцитов по разному оказывали влияние на криотолерантность ооцитов. Если сравнивать интрацитоплазматические и экстрацитоплазматические аномалии ооцитов, первые оказались более криолабильными в силу своих особенностей.

Нарушения цитоскелета клеток в случае экстрацитоплазматических аномалий возможно менее критичны при замораживании, по сравнению с нарушениями метаболизма, представленными при интрацитоплазматических аберрациях ооцитов. Необходимо, также учитывать, особенность соотношения проникающих и непроникающих криопротекторов, используемых для витрификации ооцитов, главным

Исследование качественных показателей ооцитов человека, как критерия успешной реализации витрификации в программах вспомогательных репродуктивных технологий


образом, которые направлены на стабилизацию цитоскелета, как самого уязвимого звена криоконсервации ооцитов. Данные, полученные в ходе наших исследований, подтверждают эффективность использования сочетания проникающих и непроникающих криопротекторов. Самой неблагоприятной аномалией ооцитов оказалось, появление агрегации ЭР и рефрактерных тел. Однако, даже при этой аномалии частота выживаемости ооцитов составила 87%.

На последнем этапе для подтверждения интактности, не только морфологических, но и физиологических, биохимических и генетических структур, мы провели исследование частоты нормального оплодотворения ооцитов после процедуры ИКСИ. Как видно на рисунке 4 самая низкая частота нормального оплодотворения, как и ожидалось была в группе интрацитоплазматических аномалий ооцитов, но общая частота нормального оплодотворения ооцитов составила почти 76%, что является высоким показателем не только успешной криоконсервации, но и сохранности внутриклеточных структур ооцитов.

ВЫВОДЫ


В результате проведенных нами исследований были сделаны следующие выводы:
Выявлена положительная корреляция между морфологическими показателями ооцитов и их криотолерантностью. Чем лучше морфология ооцитов, тем лучше их выживаемость после криоконсерваций.

Различные дисморфизмы ооцитов по разному оказывали влияние на криотолерантность ооцитов. Если

Исследование качественных показателей ооцитов человека, как критерия успешной реализации витрификации в программах вспомогательных репродуктивных технологий


сравнивать интрацитоплазматические и экстрацитоплазматические аномалии ооцитов, первые оказались более криолабильными в силу своих особенностей.
Самой неблагоприятной аномалией ооцитов оказалось появление агрегации ЭР и рефрактерных тел.
Высокие показатели нормальной фертилизации ооцитов являются потверждением, не только успешной криоконсервации, но и сохранности внутриклеточных структур ооцитов после размораживания.
Изучение аномалий ооцитов человека в криоциклах имеет значение не только в селекции гамет, но и в понимании роли, а также взаимодействии внутриклеточных структур клеток для нормального завершения процессов оогенеза, оплодотворения и дробления эмбрионов.

Список литературы


Bernard A., Fuller B.J. Cryopreservation of human oocytes: a review of current problems and perspectives. Human Reproduction Update. – 1996, – № 3, – P. 193-207.
Mandelbaum J., Junca A.M., Plachot M. et al. Cryopreservation of human embryos and oocytes. Human Reproduction. – 1988, – № 1, – P.117-119.
Porcu E., Fabbri R., Seracchioli R. et al. C. Birth of a healthy female after intracytoplasmic sperm injection of cryopreserved human oocytes. Fertility and Sterility. – 1990, – № 68, – P. 724-726.
Nawroth F., Kissing K. Pregnancy after intracytoplasmatic sperm injection (ICSI) of cryopreserved human oocytes . Acta Obstet Gynecol Scand. – 1998, – № 77, – P. 462-463.
Noyes N., Labella P.A., Grifo J., Knopman J. Oocyte cryopreservation: a feasible fertility preservation option for reproductive age cancer survivors. J Ass Reprod Genet. – 2010, – № 27, – P. 495-499.
Manipalviratn S., Decherney A. Clinical application of human oocyte cryopreservation. Rev Recent Clin Trials. – 2008. – № 3. – P. 104-110.
Mandelbaum J., Anastasiou O., Levy R. et al. Effects of cryopreservation on the meiotic spindle of human oocytes. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. – 2004. – № 113. – P. 17-23.
Курило Л. Закономерности овариогенеза и оогенеза млекопитающих. Хронология и динамика развития гонад, гамет и фолликулов человека и млекопитающих животных. LAP Lambert Academic Publishing. – 2012, - 292 с.
Rienzi L., Vajta G., Ubaldi F. Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature. Human Reproduction. – 2011, – № 17, – P. 34-45.
Hinduja I., Kumar A., Kumar T.C. Ultrastructure of the cortex in the human egg. Human Reproduction. – 1989, – № 5, – P. 66-70.
Balaban B, Urman B. Effect of oocyte morphology on embryo development and implantation. Reproductive Biomedicine Online. – 2006, – № 12, – P. 608-615.
Ebner T et al. Prognosis of oocytes showing aggregation of smooth endoplasmic reticulum. Reproductive Biomedicine Online. – 2008, – № 16, – P. 801-807.
Wells D., Hiller S.G. Polar bodies: their biological mystery and clinical meaning. Molecular Human Reproduction. – 2011, – № 17, – P. 273-274.
Kuwayama M., Vajta G., Kato O., Leibo S.P. Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes. Reproductive Biomedicine Online. – 2005, – № 11, – P. 300-308.


References


Bernard A., Fuller B.J. Cryopreservation of human oocytes: a review of current problems and perspectives Human Reproduction Update. – 1996. – № 3. – P. 193-207.
Mandelbaum J., Junca A.M., Plachot M. et al. Cryopreservation of human embryos and oocytes. Human Reproduction. – 1988. – № 1. – P. 117-119.
Porcu E., Fabbri R., Seracchioli R. et al. C. Birth of a healthy female after intracytoplasmic sperm injection of cryopreserved human oocytes. Fertility and Sterility. – 1990. – № 68. – P. 724-726.
Nawroth F., Kissing K. Pregnancy after intracytoplasmatic sperm injection (ICSI) of cryopreserved human oocytes. Acta Obstet Gynecol Scand. – 1998. – № 77. – P. 462-463.
Noyes N., Labella P.A., Grifo J., Knopman J. Oocyte cryopreservation a feasible fertility preservation option for reproductive age cancer survivors. J Ass Reprod Genet. – 2010. – № 27. – P. 495-499.
Manipalviratn S., Decherney A. Clinical application of human oocyte cryopreservation. Rev Recent Clin Trials. – 2008. – № 3. – P. 104-110.
Mandelbaum J., Anastasiou O., Levy R. et al. Effects of cryopreservation on the meiotic spindle of human oocytes. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. – 2004. – № 113. – P. 17-23.
Kurilo L. Zakonomernosti ovariogeneza i oogeneza mlekopitayuschih. Hronologiya i dinamika razvitiya gonad, gamet i follikulov cheloveka i mlekopitayuschih zhivotnyih. LAP Lambert Academic Publishing. – 2012, 292 s.
Rienzi L., Vajta G., Ubaldi F. Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature. Human Reproduction. – 2011, – № 17, – P. 34-45.
Hinduja I., Kumar A., Kumar T.C. Ultrastructure of the cortex in the human egg. Human Reproduction. – 1989, – № 5, – P. 66-70.
Balaban B, Urman B. Effect of oocyte morphology on embryo development and implantation. Reproductive Biomedicine Online. – 2006, – № 12, – P. 608-615.
Ebner T et al. Prognosis of oocytes showing aggregation of smooth endoplasmic reticulum. Reproductive Biomedicine Online. – 2008, – № 16, – P. 801-807.
Wells D., Hiller S.G. Polar bodies: their biological mystery and clinical meaning. Molecular Human Reproduction. – 2011, – № 17, – P. 273-274.
Kuwayama M., Vajta G., Kato O., Leibo S.P. Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes. Reproductive Biomedicine Online. – 2005, – № 11, – P. 300-308.


Түйіндеме


Адам ооцитін зерттеу сапа көрсеткіштерін пайдалана отырып, витрификацияның табыс көрсеткіші ретінде репродуктивті технологияларында іске асыру
С. Б. Байкошкарова, М. К. Отарбаева, Н. Г. Рахметова

ұрпақ өрбіту клиникасы «Экомед»
Қазақстан, Алматы


Қазіргі уқытта репродуктологияның негізгі міндеті, адам гаметалар мен эмбриондарды тиімді пайдалану. ВРТ бағдарламаларында, ооциттердің әр түрлі жарақаттары мен жиі пайда болатының көруге болады. Ооцитердің жарақаттарын екіге бөлуге болады; экстрацитоплазмалық және интрацитоплазмалық. Экстрацитоплазмалық патологияға пеллюциданың кескін ауданы мен құрылымның бұзылуы, дебристің перивителлиндық кеңестікте күрт өсуі, бірінші полярлық дененің ауытқулары(көлемінің ұлғаюы, дегенерация, мультифрагментация), және оолемма ооцитаның симметриясының бұзылуы. Интрацитоплазматикалық ооциттердің ауытқуларына цитоплзма жасушасының грануляциясы, эндоплазмалық ритикулумның тегіс агрегаты, рефракторлық дене, вакуоли, цитоплазма тұтқырлығының бұзылуы. Мақалада кироцилде ооциттердің сапасын бағалау өлшемдерін қарастырады, және криоконсервациялық әдіспен витрификацияның табысын жүзеге асыру жасушаның сапа көрсеткішіне қарай болжау.

Түйін сөздер: Ұрпақ өрбітудің қосалқы техникалар, витрификация, ооциттің сапасы, дисморфизмдар, экстракорпоральды ұрықтандыру.

Summary


Qualitative research human oocytes, as a criterion of the success vitrification in programs of the assisted reproductive technologie
S. B. Baikoshkarova, M. K. Otarbayev, N. G. Rakhmetova

Сlinic of Human reproduction «Eсomed»
Kazakhstan, Almaty


Currently, the main task of reproduction is the rational use of human gametes and embryos. In ART programs can often observe the appearance of oocytes with various damages. These lesions oocytes can be divided into two groups: extracytoplasmic and intracytoplasmic. To extracytoplasmic pathologies include violation of the structure and shape of the zona pellucida, debris in perivitelline space and areas increase, the first polar body abnormalities (increase in size, degeneration, multifragmentation), and violation of the symmetry of oocyte oolemm. To intracytoplasmic anomalies oocyte cytoplasm include granularity, smooth endoplasmic reticulum aggregates, refractory bodies, vacuoles, violation viscosity of the cytoplasm. This article discusses criteria for evaluating oocyte quality in cryocycles and forecast the success of cryopreservation by vitrification, depending on the quality indicators cells.

Key words: assisted reproductive technology, vitrification, oocyte quality, dysmorphism, in vitro fertilization.




 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  .  
 

Copyright (C) Репродуктивная медицина. Научно-практический журнал
г. Алматы, Алмалинский район, ул. Байтурсынова 79.
Тел.: +7 (727) 250 00 11, skype: medmedia.kz, e-mail: info@medmedia.kz
   
 
Яндекс.Метрика