ГЛАВНАЯ ЖУРНАЛЫ СОБЫТИЯ ИЗДАНИЯ КОНГРЕСС О НАС КОНТАКТЫ  

ПРОВЕДЕНИЕ ПРЕИМПЛАНТАЦИОННОГО ГЕНЕТИЧЕСКОГО СКРИНИНГА В РЕЗУЛЬТАТЕ БИОПСИИ ТРОФЭКТОДЕРМЫ НА КРИОКОНСЕРВИРОВАННЫХ ЭМБРИОНАХ (КЛИНИЧЕСКИЕ СЛУЧАИ)
 
М. С. Шишиморова, С. И. Тевкин, В. Е. Полумисков, В. Н. Локшин

Институт Репродуктивной Медицины, Центр «ЭКО», г. Алматы (Казахстан)

Резюме


Проведение генетической диагностики на преимплантационных эмбрионах с целью выявления различных хромосомных аномалий позволяет провести селекцию и отобрать эмбрионы с наибольшим имплантационным потенциалом и снизить риск рождения ребенка с наследственными генетическими заболеваниями. В рамках программ генетической диагностики наибольший удельный вес занимает преимплантационный генетический скрининг анеуплоидий. Нами проведено небольшое количество программ по результатам которых частота наступления клинической беременности после выполнения ПГС на размороженных эмбрионах составила 50%, частота имплантации – 42,8%. Проведенное исследование демонстрирует возможность проведения скрининга анеуплоидий методом FISH на криоконсервированных бластоцистах после биопсии трофэктодермы и может являться одним из способов повышения эффективности программ ВРТ.

Summary


Preimplantation genetic diagnosis on human embryos for identification the different chromosomal abnormalities allows us to select embryos with the highest implantation potential and reduce the risk of having a child with inherited genetic diseases. Most part of PGD programs takes aneuploidy screening. Although the number of patients in this case series was small we had found that clinical pregnancy rates was (50%) and implantation rate (42,8%). This study demonstrates the feasibility of aneuploidy screening by FISH-analysis cryopreserved blastocysts after trophectoderm biopsy and can be one of the ways to improve the effectiveness of ART programs.

Ключевые слова: бластоцисты, криоконсервация, биопсия трофэктодермы, преимплантационный генетический скрининг (ПГС), анеуплоидии.
Keywords: blastocyst, cryopreservation, trophectoderm biopsy, preimplantation genetic diagnosis screening (PGS), aneuploidies.


Введение

Преимплантационная генетическая диагностика (ПГД) доказала свою высокую эффективность в рамках программ вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). Наличие у эмбрионов хромосомной патологии может являться причиной остановки в развитии, так как даже эмбрионы с хорошими морфологическими характеристиками имеют высокий процент хромосомных нарушений.

Результат анализа генетического материала после биопсии преимплантационных эмбрионов позволяет получить информацию о моногенных заболеваниях или хромосомных нарушениях, которая помогает отобрать эмбрион с наибольшим имплантационным потенциалом и снизить риск рождения ребенка с наследственными генетическими заболеваниями [13].

В рамках программы генетической диагностики наибольший удельный вес занимает преимплантационный генетический скрининг (ПГС) анеуплоидий. Информация, полученная в результате исследования, является важным аргументом селекционного процесса, основанным не только на морфологических, но и генетических характеристиках эмбриона [11,12]. Генетический скрининг анеуплоидий позволяет определить хромосомный статус эмбрионов и выбрать эуплоидные эмбрионы на перенос. Это дает возможность снизить уровень спонтанных абортов, уменьшить риск рождения детей с генетическими отклонениями, т.е. увеличивает вероятность рождения здорового ребенка [12,16].

Введение в практику лабораторий ЭКО продленного культивирования позволяет получить достаточное количество эмбрионов для выбора лучших на перенос, а оставшиеся после переноса эмбрионы отличного и хорошего качества, как будущий резерв, подвергают криоконсервации с целью дальнейшего использования т.к. перенос даже морфологически качественных эмбрионов не всегда обеспечивает полноценную завершенную беременность.

Пациенты, у которых предыдущие программы ЭКО/ИКСИ завершились неудачно: замершие беременности, самопроизвольные выкидыши и аборты с выявленными хромосомными нарушениями в результате кариотипирования абортивного материала, а также вынужденное прерывание беременности в связи с наличием у плода генетических аномалий (синдром Дауна, Патау, Эдвардса и т.д.) – все это показания для проведения генетического тестирования криоконсервированных эмбрионов.

Использование в лабораториях ЭКО современного и высокотехнологичного оборудования (микроскоп Olympus, Nikon, Leica, Zeiss и лазер Saturn 5, Octax), а также принципиально новых методов генетической диагностики (mCGH, snp-CGH, NewGenerationSiq) дает возможность проведения биопсии трофэктодермы на стадии бластоцисты. Этот подход дает ряд потенциальных преимуществ над биопсией бластомера: возможность получения при биопсии сразу нескольких клеток для диагностики, снижение рисков потери ядра при фиксации, быстрая регенерация бластоцисты, снижение риска ошибки при анализе и, как следствие, увеличение эффективности метода.

Несмотря на возможность проведения ПГД на криоконсервированных эмбрионах, существует относительно мало публикаций о успешном применении данного метода [3,6]. В связи с этим, актуальным становится вопрос о возможности проведения преимплантационного генетического скрининга на ранее замороженных бластоцистах с использованием метода биопсии трофэктодермы – как одного из способов повышения эффективности программ ВРТ.

Цель исследования

Изучить возможность проведения скрининга анеуплоидий методом FISH (Fluorescent in situ hybridization) на криоконсервированных бластоцистах, оценить эффективность применения данного метода, частоту наступления клинической беременности и частоту имплантации.

Материалы и методы

Исследование проводилось в рамках программы перенос размороженных эмбрионов (ПРЭ) после проведения преимплантационнного генетического скрининга (декабрь 2012 г. – июль 2013 г.) в Центре «ЭКО» Института Репродуктивной Медицины (ИРМ) г. Алматы. Показания к проведению ПГС: 3 и более неудачные попытки ВРТ в анамнезе, спонтанное прерывание беременности и самопроизвольные аборты, наличие хромосомных аномалий у плода или в абортивном материале.

Индукцию суперовуляции проводили стандартными схемами стимуляции: длинные и короткие протоколы с агонистами ГнРГ или короткие протоколы с антагонистами ГнРГ. Через 36-38 ч после триггера овуляции, проводили трансвагинальную пункцию (ТВП) под контролем УЗИ яичников. Оплодотворение ооцитов проводили стандартными методами ЭКО/ИКСИ, через 3±1 ч после получения их на ТВП. Культивирование эмбрионов проводилось в течение 5 дней до стадии бластоцисты в инкубаторах SANYO, VAROLAB (6%СО2) и мини- инкубаторах PLANER (6%СО2,

ПРОВЕДЕНИЕ ПРЕИМПЛАНТАЦИОННОГО ГЕНЕТИЧЕСКОГО СКРИНИНГА  В РЕЗУЛЬТАТЕ БИОПСИИ ТРОФЭКТОДЕРМЫ НА КРИОКОНСЕРВИРОВАННЫХ  ЭМБРИОНАХ (КЛИНИЧЕСКИЕ СЛУЧАИ)


5%О2, 89%N2) при T 37,1оС в соответствии с рекомендуемыми параметрами. Для криоконсервации бластоцист использовали среду BlastFreeze (Origio, Denmark) и медленный протокол замораживания с программным обеспечением (CryoLogic, Australia). Размораживание бластоцист проводили за сутки до предполагаемого переноса с использованием среды BlastThaw, c дальнейшим культивированием в среде BlastAssist (Origio, Denmark).

В начале рабочего дня оценивали качество и выбирали эмбрионы для проведения биопсии. Для проведения биопсии отбирали бластоцисты качества не ниже 2ВВ по классификации Гарднера [4]. При помощи лазерной системы Saturn 5 (Reseach Instrument, UK) выполняли биопсию клеток трофэктодермы.
Фиксацию ядер на слайде и гибридизацию проводили по стандартной методике с некоторыми модификациями [15].

Для FISH-анализа использовали флуоресцентные зонды Vysis MultiVysion (Abbott Molecular, USA) на 5 хромосом (13,18,21,Х,У). Обработку и анализ флюоресцентных сигналов проводили на платформе CytoVision (Leica Biosystems). Переносы исследованных эуплоидных эмбрионов в полость матки проводили в этот же день в среде для переноса эмбрионов UTМ (Origio, Denmark). Время

ПРОВЕДЕНИЕ ПРЕИМПЛАНТАЦИОННОГО ГЕНЕТИЧЕСКОГО СКРИНИНГА  В РЕЗУЛЬТАТЕ БИОПСИИ ТРОФЭКТОДЕРМЫ НА КРИОКОНСЕРВИРОВАННЫХ  ЭМБРИОНАХ (КЛИНИЧЕСКИЕ СЛУЧАИ)


от проведения биопсии до переноса эмбрионов составляло от 5 до 6 часов.
Результаты исследования оценивались по следующим параметрам: жизнеспособность эмбрионов после размораживания, частота наступления клинической беременности на перенос и частота имплантации.

Результаты исследования и обсуждение

С целью изучения возможности проведения скрининга анеуплоидий, методом FISH на замороженных бластоцистах, было проведено 7 программ, 6 из которых закончились переносом эмбрионов. Результаты генетического анализа криоконсервированных бластоцист после биопсии трофэктодермы представлены в таблице 1.

Средний возраст пациенток в программах ПГС на размороженных эмбрионах 5 суток развития, составил 37,2±3 лет. Было разморожено 29 бластоцист, процент жизнеспособных эмбрионов после размора

ПРОВЕДЕНИЕ ПРЕИМПЛАНТАЦИОННОГО ГЕНЕТИЧЕСКОГО СКРИНИНГА  В РЕЗУЛЬТАТЕ БИОПСИИ ТРОФЭКТОДЕРМЫ НА КРИОКОНСЕРВИРОВАННЫХ  ЭМБРИОНАХ (КЛИНИЧЕСКИЕ СЛУЧАИ)


живания составил 68,9,8% (20/29). В соответствии с критериями отбора по качеству развития, биопсия трофэктодермы была проведена у 85,0% (17/20) размороженных бластоцист.

В ходе проведенного FISH-анализа были получены следующие результаты (таблица 2.): соотношение количества эуплоидных к анеуплоидным эмбрионов составило 47,1% и 52,9%, соответственно. Один перенос был отменен по результатам ПГС в связи с отсутствием эуплоидных эмбрионов. Среднее количество эмбрионов на перенос составило 1,16. В результате проведенного исследования частота наступления клинической беременности на перенос после проведения ПГС на размороженных бластоцистах составила 50% (3/6), частота имплантации 42,8 (3/7)%.

Полученные предварительные результаты показывают, что проведение преимплантационного генетического скрининга на ранее криоконсервированных бластоцистах возможно и осуществимо, и приводит к успешной завершенной беременности. Наши данные согласуются с результатами исследования, в котором было проведено 13 циклов ПГС на размороженных бластоцистах, 8 из которых завершились переносом эуплоидных эмбрионов. Частота наступления беременности на перенос составила 63,0%, частота имплантации – 46,0% [8].

Хотя количество пациентов в нашем исследовании было недостаточным для проведения статистического анализа, высокая частота наступления клинической беременности (50%) и частота имплантации (42,8%) после биопсии трофэктодермы и проведения ПГС на размороженных эмбрионах выглядит обнадеживающе и, возможно, позволит увеличить эффективность программ ВРТ, что особенно актуально для женщин старшего репродуктивного возраста, пациенток с многочисленными неэффективными попытками ЭКО/ИКСИ в анамнезе и неудачами имплантации, что также положительно сказывается на результативности программ ВРТ по данным ряда литературных источников [4,8,9,10].

ПРОВЕДЕНИЕ ПРЕИМПЛАНТАЦИОННОГО ГЕНЕТИЧЕСКОГО СКРИНИНГА  В РЕЗУЛЬТАТЕ БИОПСИИ ТРОФЭКТОДЕРМЫ НА КРИОКОНСЕРВИРОВАННЫХ  ЭМБРИОНАХ (КЛИНИЧЕСКИЕ СЛУЧАИ)


Для проведения ПГД используют различные методы, в том числе: биопсию первого и второго полярного тела, биопсию бластомера на стадии дробления и биопсию трофэктодермы на стадии бластоцисты [6]. Потенциальное преимущество последнего, биопсия трофэктодермы, которая дает возможность получения большего количества клеток для анализа, что позволяет более точно и качественно провести генетическую диагностику. Опубликованная на сегодняшний день большая серия исследований по биопсии трофэктодермы на «свежих» эмбрионах демонстрирует высокую жизнеспособность бластоцист после проведения биопсии, а также высокий уровень частоты наступления клинической беременности (более 40%) и живорождения [13].

Несмотря на все преимущества проведения биопсии на эмбрионах 5-х суток развития, все же существуют некоторые ограничения в использовании данного метода. Важными моментами являются стадия развития бластоцисты и ее качество. В наших исследованиях мы отбирали бластоцисты после размораживания только отличного и хорошего качества, без фрагментаций и признаков дегенерации, которые потенциально имели высокие шансы к имплантации.

Критическую роль играет время проведения генетического анализа и переноса эмбрионов, поскольку важным фактором является окно имплантации. В стандартных условиях время, затрачиваемое на проведение генетического анализа, занимает от 12 до 24 часов, подобранные нами условия проведения фиксации ядер, гибридизации и интерпретации результатов дало возможность проводить полный цикл (биопсию, FISH диагностику и перенос тестированных эмбрионов в полость матки) в максимально короткие сроки от 5 до 6 часов.

Выводы

Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют о возможности проведения скрининга анеуплоидий методом FISH на замороженных бластоцистах, что может являться одним из способов повышения эффективности программ ВРТ. В результате проведенных исследований частота наступления клинической беременности после проведения ПГС на размороженных бластоцистах составила 50%, частота имплантации 42,8%.

Подобранные условия проведения ПГС с использованием FISH-метода позволяют в максимально короткие сроки осуществлять отбор эмбрионов без хромосомной патологии для их селективного переноса в полость матки, что особенно актуально для пациентов, у которых сохранился резерв замороженных эмбрионов 5 суток развития, которые сталкивались с генетическими проблемами плода, замершими беременностями и многочисленными неудачными попытками ЭКО/ИКСИ в анамнезе. Необходимы дальнейшие, более масштабные исследования с проведением статистического анализа, чтобы оценить долгосрочные результаты и клиническое применение данного метода.

ЛИТЕРАТУРА:

Baruch S., Kaufman D., Hudson K. L. Genetic testing of embryos: practices and perspectives of US in vitro fertilization clinics. Fertil. Steril. 2008; 89:p. 1053-1058
de Boer K. A., Catt J. W., Jansen R. P., Leigh D., McArthur S. Moving to blastocyst biopsy for preimplantation genetic diagnosis and single embryo transfer at sydney IVF. Fertil. Steril. 2004; 82:p. 295-298
Frydman N., Ray P., Romana S., Fanchin R., Lelorc’h M., Kerbrat V., Frydman R., Tachdjian G. First birth after preimplantation genetic diagnosis performed on thawed embryos. J. Gynecol. Obstet. Biol. Reprod. (Paris) 2003; 32:p. 363-367
Gardner D. K., Schoolcraft W. B. In vitro culture of human blastocysts. In: Jansen R., Mortimer D. (eds). Toward Reproductive Certainty: Fertility and Genetics Beyond 1999. UK: Parthenon Publishing London, 1999, 378-388
Gianaroli L., Magli M. C., Ferraretti A. P., Munne S. Preimplantation diagnosis for aneuploidies in patients undergoing in vitro fertilization with a poor prognosis: identification of the categories for which it should be proposed. Fertil Steril 1999; 72:p. 837-844
Treff N. R. et al. Development and validation of an accurate quantitative real-time polymerase chain reaction-based assay for human blastocysts comprehensive chromosomal aneuploidy screening. Fertil Steril. 2012;97:819–824, e. 812
Hoffman D. I., Zellman G. L., Fair C. C., Mayer J.F., Zeitz J. G., Gibbons W. E., Turner Jr., T.G. Society for Assisted Reproduction Technology (SART) and RAND Cryopreserved embryos in the United States and their availability for research. Fertil. Steril. 2003; 79: p. 1063-1069
Lathi R. B., Behr B. Pregnancy after trophectoderm biopsy of frozen-thawed blastocyst. Fertil. Steril. 2009; 91: p. 1938-1940
Lyerly A. D., Steinhauser K., Voils C., Namey E., Alexander C., Bankowski B., Cook-Deegan R., Dodson W. C., Gates E., Jungheim E. S., McGovern P. G., Myers E. R., Osborn B., Schlaff W., Sugarman J., Tulsky J. A., Walmer D., Faden R. R., Wallach E. Fertility patients’ views about frozenembryo disposition: results of a multi-institutional U.S. survey. Fertil. Steril. 2010; 93:p. 499-509
Rubio C., Simon C., Vidal F. et al. Chromosomal abnormalities and embryo development in recurrent miscarriage couples. Hum Reprod, 2003; 18:p. 182-188
Munne S. et al. Spontaneous abortions are reduced after preconception of translocations. J Ass Reprod Genet 1998; 15(5):p. 290-296
Munne S., Magli M. C., Cohen J. et al. Positive outcome after preimplantation diagnosis of aneuploidy in human embryos. Hum Reprod, 1999; 14:p.2191-2199
McArthur S. J., Leigh D., Marshall J. T., de Boer K. A., Jansen R. P. Pregnancies and live births after trophectoderm biopsy and preimplantation genetic testing of human blastocysts. Fertil. Steril. 2005; 84:p. 1628-1636
Schoolcraft W. B., Treff N.R., Stevens J. M., Ferry K., Katz-Jaffe M., Scott Jr. R. T. Live birth outcome with trophectoderm biopsy, blastocyst vitrification, and single-nucleotide polymorphism microarray-based comprehensive chromosome screening in infertile patients. Fertil. Steril. 2011; 96:p. 638-640
Tarkowsky A. K. An air drying method for chromosome preparation from mouse eggs. Cytogenetic s1964:5:р. 394-400
Simpson J. L. Preimplantation genetic diagnosis at 20 years. Prenat. Diagn. 2010; 30: p. 682-695




 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  .  
 

Copyright (C) Репродуктивная медицина. Научно-практический журнал
г. Алматы, Алмалинский район, ул. Байтурсынова 79.
Тел.: +7 (727) 250 00 11, skype: medmedia.kz, e-mail: info@medmedia.kz
   
 
Яндекс.Метрика