ГЛАВНАЯ ЖУРНАЛЫ СОБЫТИЯ ИЗДАНИЯ КОНГРЕСС О НАС КОНТАКТЫ  

АЛГОРИТМ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ОБСЛЕДОВАНИЯ ПАЦИЕНТОВ С НАРУШЕНИЕМ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ
 
Е.В. Маркова,Н.В. Зотова, Н.В. Казьмина, И.Ю.Тимофеева, Д.А. Татару,

О.А. Серебренникова, А.В.Светлаков

 Красноярский центр репродуктивной медицины, г.Красноярск

 

В настоящее время необходимости генетического обследованияпациентов с нарушением репродуктивной функции уделяется все большее внимание. Это связано как с развитием представлений о роли генетических факторов в этиологии бесплодия и невынашивания беременности, так и с расширением диагностических возможностей в области лабораторной генетики.Несмотря на стремительное развитие методов генетики и молекулярной биологии, при обследовании пациентов с репродуктивными нарушениями в клинической практике возникает много сложных вопросов. В первую очередь,не определен объем и алгоритм обследования, поэтому может быть достаточно интересным опыт медицинских учреждений и лабораторий, работающих в области репродуктивной генетики.

Супружеские пары, имеющие генетические нарушения,требуют особого подхода в лечении, поскольку необходимо учитывать генетический риск и использовать доступные в настоящее время методы профилактики наследственной патологии. Для эффективной работы в этой междисциплинарной области важнейшее значение имеет не только взаимодействие специалистов:гинекологов, эндокринологов, урологов, андрологов и генетиков, но и организация генетических исследований, в том числе контроль качества.

Генетическое обследование включаетмедико-генетическое консультирование, молекулярно-генетические (анализ единичных генов) и цитогенетические (анализ хромосом) лабораторные исследования. Красноярский центр репродуктивной медицины (КЦРМ) проводит генетическое обследование при бесплодии и невынашивании беременности с 2004 года. За это время обследованооколо 4 тыс. человек.

 Медико-генетическое консультирование. Врач-генетик наилучшим образом может определить объем генетического обследования, интерпретировать результаты генетических исследований. В то же время необходимо, чтобы врач-генетик, консультирующий по вопросам нарушения репродуктивной функции, владел знаниями в области вспомогательных репродуктивных технологий.

Направить на генетическое исследование может не только врач-генетик, но и гинеколог, андролог или врач другой специальности, к которым первично обращается пациент (супружеская пара). По результатам исследований, особенно при выявлении генетического нарушения, консультация врача-генетика обязательна. В случае наследственного заболевания консультация генетика необходима даже при отрицательных результатах генетического тестирования. Проведение генетического тестирования без предоставления генетического консультирования не этично /Ижевская, 2006/. У врача-генетика имеется специфический круг вопросов, которыми не занимаются врачи другого профиля. Этоопределение риска передачи генетического нарушения по наследству, методы профилактики наследственной патологии, информирование о необходимости обследования для других членов семьи.

Особой областью генетического консультирования является преимплантационная генетическая диагностика (ПГД), требующая этапного консультирования/Светлаков с соавт., 2008/. В ходе ПГД супружеская пара сталкивается со сложными вопросами, и медико-генетическое консультирование имеет большое значение для принятия оптимальных решений.

 Лабораторно-генетические исследования. В таблице 1 представлен объем лабораторно-генетического обследования, проводимого в КЦРМ при женском бесплодии, мужском бесплодии, невынашивании беременности в супружеской паре. Данный перечень был сформирован на основании анализа литературы, полученной специалистами подготовки в области медицинской генетики, международных стандартов, а также собственного опыта работы.

 

Таблица 1. Лабораторно-генетические исследования, проводимые в КЦРМ при бесплодии и невынашивании беременности

algoritm-gen-issled-tabl1.jpg

 

В ходе лабораторно-генетического обследования важное значение имеют возможности сочетания цитогенетических и молекулярно-генетических исследований. Так, при генетических нарушениях детерминации пола заключение о генетическом нарушении может быть дано только при анализе кариотипа и молекулярно-генетическом исследовании генов SRY (пол-определяющего региона Y-хромосомы) и AMG(амилогенина).

Для проведения молекулярно-генетических и цитогенетических исследований требуютсяобразцыкрови с разными антикоагулянтами. В целях оптимизации процедуры забора крови для генетических анализов в КЦРМ было выполнено специальное исследование. Его результаты показали, чтопри необходимости единовременного забора крови на цитогенетические и молекулярно-генетические исследования,допустимо забирать кровь в одну пробирку с гепарином /Маркова с соавт., 2008/.При выполнении молекулярно-генетических исследований в КЦРМ часто реализуется транспортная схема по доставке материала, поскольку биологические образцы, при соблюдении определенных правил забора и хранения могут транспортироваться при комнатной температуре по почте.

Качественное проведение лабораторно-генетических исследований зависит от организации работы лаборатории: набор помещений с учетом технологических особенностей генетических исследований, оборудование, подготовку специалистов, и систему контроля качества как внутренней, так и внешней. В области лабораторной генетики в РФ федеральная система контроля качества существует только для цитогенетических исследований. КЦРМ принимает участие в ней с 2006 года.

 Цитогенетические исследования, Из всех лабораторно-генетических исследований анализ кариотипа имеет наиболее широкие показания(табл.1). Аномалии кариотипа могут приводить как к нарушению формирования гамет и бесплодию, так и к формированию несбалансированных гамети, как следствие, невынашиванию беременности или отсутствию имплантации /Gardner, Sutherland, 2004/. Кариотипирование в КЦРМ включает стандартное дифференциальное G-окрашивание. При анализе хромосомных перестроек или хромосомного полиморфизма в рамках кариотипирования проводится дополнительное С- или Ag-окрашивание, а при подозрении на мозаицизм - FISH-анализ (на хромосомы X и Y). Анализ частоты выявления хромосомных нарушений среди пациентов КЦРМ с бесплодием составляет около 4% /Зотова с соавт., 2007/. Кроме стандартного цитогенетического обследования в некоторых сложных случаях проводится дополнительное молекулярно-цитогенетическое исследование с применением методов FISH (флуоресцентная гибридизация in situ) и SKY (спектральное кариотипирование) /Зотова с соавт., 2009/. Необходимость такого дополнительного обследования с применением SKY или FISH определяется цитогенетиком в ходе стандартного кариотипирования или врачом-генетиком.

Выявление отклонений в кариотипе определяет необходимость обязательного медико-генетического консультирования. Генетический риск и рекомендации по планированию беременности существенно зависят от типа выявленного хромосомного нарушения.

При невынашивании беременности особое значение имеет не только кариотипирование обоих супругов, но и кариотипирование абортивного материала. Такой цитогенетический анализ методически достаточно сложен, однако его результаты имеют важное прогностическое значение для дальнейшего планирования беременности /Махалова с соавт., 2010/.

 Молекулярно-генетические исследования. К настоящему времени описано большое число генных нарушений (как мутаций, так и полиморфизмов), ассоциированных с нарушением репродуктивной функции/Simpson, Elias, 2003; Oehninger, Kruger, 2007/. Однако, в клинической практике возможно использование анализа лишь основных генетических нарушений, для которых разработаны диагностические подходы. В то же время нет никаких устоявшихся рекомендаций по перечню обследования и числу исследуемых мутаций в каждом гене. На сегодняшний день фирмами-производителями генетических тест-систем и лабораториями предлагается исследование полиморфизмов,зачастую не имеющихдоказанной клинической значимости. Поэтому определение объема молекулярно-генетического обследования зависит от квалификации специалистов именно в области медицинской лабораторной генетики.

Основной перечень молекулярно-генетических исследований, проводимых в КЦРМ для пациентов с нарушением репродуктивной функции, представлен в таблице 1. Во всех случаях на первом этапе проводится выделение ДНК из биологического материала (в основном, кровь, реже – буккальный эпителий).Для молекулярно-генетического анализа применяются методы ПЦР (включая модификации – флуоресцентная ПЦР, ПЦР в реальном времени), рестрикционного анализа, электрофореза в полиакриламидном геле, фрагментного анализа на генетическом анализаторе.

AZF-анализ рекомендован мужчинам с тяжелыми нарушениями сперматогенеза (при концентрации сперматозоидов менее 5 млн/мл). Потеря генов изрегионаAZF(фактора азооспермии) Y-хромосомы, ответственных за сперматогенез (микроделеции Y-хромосомы), приводит к нарушению образования и созревания сперматозоидов. Для пациентов с микроделециями Y-хромосомы консервативное лечение нецелесообразно, поскольку не даст результата. Рекомендации по проведению диагностической биопсии яичек зависят от типа выявленной микроделеции. При проведении ИКСИ с собственными сперматозоидами рекомендуется ПГД.

М CFTR-анализ проводится пациентам с обструктивными формами нарушений параметров эякулята. Мутации гена CFTR (трансмембранного регулятора муковисцидоза) могут являться причиной, как тяжелого наследственного заболевания муковисцидоза, так и синдрома аплазии семявыносящих протоков. В случае скринингового исследования пациентов с мужским бесплодием в КЦРМ в настоящее время анализируются 15 мутаций. При установленном диагнозе синдрома аплазии семявыносящих протоков, а также для женщин, у которых мутация выявлена у супруга, рекомендуется расширенный анализ из 39 мутаций.

CYP21-анализ рекомендован пациенткам с подозрением на простую вирильную или неклассическую форму адреногенитального синдрома, гиперандрогенией надпочечникового генеза, бесплодием, невынашиванием беременности. Адреногенитальный синдром – это наследственное заболевание с чрезвычайно разнообразной клиникой: от тяжелых нарушений, приводящих к смерти новорожденного, порокам развития наружных половых органов у девочек, до легких форм, выявляющихся в период полового созревания. Неклассическая форма адреногенитального синдрома проявляется бесплодием и невынашиванием беременности. Форма заболевания зависит от мутаций гена CYP21A2 (гена 21-гидрогсилазы) в генотипе, которые могут быть «мягкими» и «тяжелыми». Пациентки с неклассической формой заболевания могут являться носителями одной «мягкой» и одной «тяжелой» мутации и, соответственно, иметь риск разных форм заболевания. Молекулярно-генетический анализ адреногенитального синдрома достаточно сложен, поскольку требует уверенности в дифференциальной диагностике мутаций именно в гене, а не в близко сцепленном с ним псевдогене. Кроме того, необходим анализ перестроек между геном и псевдогеном.

FMR-анализ показан женщинам с ранним началом климакса (в возрасте 30 лет), слабым ответом яичников на стимуляцию в цикле ЭКО (эстракорпорального оплодотворения). Выявление носительства мутаций гена FMR1 определяет высокий риск синдрома ломкой Х-хромосомыу детей мужского пола. Обследование на это заболевание также показано женщинам, имеющим ребенка или родственников мужского пола с синдромом ломкой Х-хромосомы или умственной отсталостью неясной причины, аутизмом, задержкой психо-речевого развития.

Анализ генетической предрасположенностик тромбофилии рекомендуется для определения факторов риска развития тромботических осложнений во время беременности. Спектр генетических факторов предрасположенности в настоящее время варьирует в разных лабораториях. Среди ведущих факторов – полиморфизм генов факторов свертывания крови: второго(F2), пятого (F5; мутация Лейдена) и фибриногена (FGB). Анализ предрасположенности к тромбозам также включает анализ полиморфизма гена метилентетрагидрофолат редуктазы (MTHFR), тромбоцитарных гликопротеинов (интегрина альфа 2 ITGA2, интегрина бета 3 ITGB3), ингибитора активатора плазминогена (SERPINE1 или PAI1). Выявление генетических факторов предрасположенности к тромбозам позволяет своевременно провести терапию для профилактики тромбообразования. Такая терапия также имеет важное значение для снижения риска самопроизвольного прерывания беременности.

 Обследование перед ПГД. Пациенты, имеющие показания для проведения генетического тестирования эмбрионов нуждаются в дополнительном обследовании в зависимости от типа ПГД (табл.2). Для всех типов ПГД необходимо медико-генетическое консультирование перед лечебным циклом и перед переносом эмбрионов. В КЦРМ применяются технологии ПГД, разработанные школой Ю.Верлинского с соавт. в Чикагском институте репродуктивной генетики /Verlinsky, Kuliev, 2005/.

 

Таблица 2. Типы ПГД, показания и лабораторно-генетические исследования в рамках подготовительного этапа, проводимые в КЦРМ

algoritm-gen-issled-tabl2.jpg 

В случае наиболее распространенного типа ПГД – анализа анеуплоидии эмбрионов, дополнительного подготовительного этапа не требуется. Необходимо, чтобы оба супруга были кариотипированы на этапе обследования перед лечебным циклом. Если в кариотипе супругов не выявлено отклонений, то хромосомный анализ эмбрионов направлен на выявление наиболее частых анеуплоидий, возникающий denovo. В зависимости от клинической ситуации в КЦРМ проводится FISH-анализ на 3 хромосомы (21, X, Y), 5-7 хромосом (13, 16, 18, 21, 22 / X, Y), 7-9 хромосом (13, 15, 16, 17, 18, 21, 22 / X, Y).Анализ результатов ПГД анеуплоидий, проводимый в КЦРМ, подтверждают высокий процент анеуплоидных эмбрионов /Артюхова с соавт., 2007/.

В случае перестроек в кариотипе одного из супругов ПГД направлена на снижение риска несбалансированных хромосомных нарушений у эмбрионов, что является фактором риска рождения ребенка с хромосомной болезнью, а также имплантационных потерь и риском прерывания беременности. Для проведения такого типа ПГД необходим подготовительный этап, включающий подбор FISH-зондов, заказ FISH-зондов и их тестирование на лимфоцитах и на сперматозоидах (в случае, если носитель перестройки мужчина). Подготовительный этап необходим в данном случае в связи с тем, что в перестройку в кариотипе могут быть вовлечены любые хромосомы, стандартный набор FISH-зондов не пригоден и необходима индивидуализированная схема FISH-анализа.

ПГД моногенных дефектов проводится для супружеских пар с высоким генетическим риском в отношении моногенных болезней, которые являются тяжелыми, проявляются в раннем возрасте, приводят к ранней инвалидизации, гибели ребенка и плохо поддаются лечению. При этом супружеская пара может не иметь проблем с наступлением и вынашиванием беременности. Весь цикл ЭКО/ИКСИ+ПГД направлен исключительно на снижение генетического риска – для выбора эмбриона без мутаций, ответственных за наследственное заболевание. Для проведения такого типа ПГД обязательно необходим подготовительный этап, в ходе которого подбирается схема тестирования моногенного дефекта, приемлемая для использования на единичных клетках. Такая схема помимо мутации включает анализ сцепленных с мутацией маркеров, что существенно повышает точность диагностики. Для выбора информативных маркеров необходим анализ ДНК родственников супружеской пары (детей или родителей).

В КЦРМ принят следующий алгоритм обследований в ходе подготовительного этапа перед ПГД для хромосомных перестроек и моногенных болезней. На первом этапе врач-генетик заполняет запрос на ПГД для лаборатории генетики. Если проведение ПГД для данного генетического нарушения возможно, то с пациентами заключается договор на проведение подготовительного этапа. Подготовительный этап занимает 2-3 месяца. Супружеская пара начинает лечебный цикл ЭКО/ИКСИ только после окончания подготовительного этапа.

Таким образом, алгоритм генетического обследования для пациентов с нарушением репродуктивной функции, выработанный в КЦРМ, включающий перечень и объем лабораторно-генетических исследований, позволяет осуществлять эффективное выявление и профилактику генетической патологии в ходе лечения методами ВРТ.

 

ЛИТЕРАТУРА

 

1.                 Артюхова В.Г., Лебедев И.Н., Серебренникова О.А., Светлаков А.В. Структура

численных хромосомных нарушений в преимплантационных эмбрионах человека // Генетика человека и патология.- Томск.- 2007.- С.215-219.

2.                 Зотова Н.В., Маркова Е.В., Казьмина Н.В. и др. Цитогенетическое обследование

пациентов программ вспомогательной репродукции в Красноярском центре репродуктивной медицины // Проблемы репродукции.- 2007.- №6.- С.20-24.

3.                 Зотова Н.В., Маркова Е.В., Тимофеева И.Ю. и др. Идентификация точек разрывов

при структурных хромосомных перестройках у мужчин с нарушением репродуктивной функции // Якутский медицинский журнал.- 2009.- 2(26).- С.75-78.

4.                 Ижевская В.Л. Этические и правовые аспекты генетического тестирования и

скрининга / Матер. Всеросс. научно-практич. конф. «Молекулярные методы диагностики моногенных заболеваний: возможности и перспективы» // Медицинская генетика.- 2006.- Т.5, Приложение 1.- С.3-9.

5.                 Маркова Е.В., Казьмина Н.В., Зотова Н.В. Сравнительный анализ молекулярно-

генетических исследований на образцах ДНК, выделенных из крови с ЭДТА и гепарином // Клиническая лабораторная диагностика.- 2008.- №3.- С.13-15.

6.                 Махалова Н.А., Новосельцева А.В., Зотова Н.В. и др. Кариотип абортусов от

неразвивающихся беременностей, наступивших в результате лечения бесплодия, в том числе методами ВРТ // Матер. XX междун. конф. Российской Ассоциации репродукции человека «Репродуктивные технологии сегодня и завтра» (6-8 сентября 2010).- Нижний Новгород.- 2010.- С.31.

7.                 Светлаков А.В., Маркова Е.В., Казанцева О.М., Артюхова В.Г., Назаренко Л.П.

Вопросы медико-генетического консультирования при преимплантационной генетической диагностике // Медицинская генетика.- 2008.- Т.7, №12.- С.16-24.

8.                 GardnerR.J.McK., SutherlandG.R. ChromosomeAbnormalitiesandGenetic

Counseling.- OUP.- 2004.- 577p.

9.                 Simpson J.L., Elias S. Genetics in obstetrics and gynecology.- Saunders (An Imprint of

Elsevier, USA).- 2003.- 484p.

10.             Oehninger S.C., Kruger T.F. Male Infertility. Diagnosis and Treatment. 2007. 468 p.

Verlinsky Y., Kuliev A. Atlas of preimplantation genetic diagnosis.- Taylor and Francis, 2005.- 288 p.





 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  .  
 

Copyright (C) Репродуктивная медицина. Научно-практический журнал
г. Алматы, Алмалинский район, ул. Байтурсынова 79.
Тел.: +7 (727) 250 00 11, skype: medmedia.kz, e-mail: info@medmedia.kz
   
 
Яндекс.Метрика