ГЛАВНАЯ ЖУРНАЛЫ СОБЫТИЯ ИЗДАНИЯ КОНГРЕСС О НАС КОНТАКТЫ  

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРОВЕДЕНИЯ ПРЕИМПЛАНТАЦИОННОГО ГЕНЕТИЧЕСКОГО СКРИНИНГА АНЕУПЛОИДИЙ МЕТОДОМ FLUORESENT IN SITU HYBRIDIZATION (FISH) ПОСЛЕ БИОПСИИ БЛАСТОМЕРА ИЛИ ТРОФЭКТОДЕРМЫ
 
М. С. Шишиморова, С. И. Тевкин, В. Н. Локшин

Институт Репродуктивной Медицины, Центр «ЭКО», г. Алматы (Казахстан)
Institute of Reproductive Medicine, IVF center, Almaty (Kazakhstan)


Резюме


Преимплантационный генетический скрининг (ПГС) анеуплоидий занимает наибольший удельный вес в рамках программы генетической диагностики. Широко используемым в программе ПГС является генетический скрининг анеуплоидий методом флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) после биопсии бластомера на 3 день развития эмбриона. Использование данного метода имеет ряд недостатков: риск остановки развития эмбрионов, высокий процент мозаицизма, отсутствие или потеря ядра при фиксации, уменьшения, в результате микроманипуляций, количества клеток для дальнейшего формирования бластоцисты и др.

Ключевые слова: преимплантационный генетический скрининг (ПГС), биопсия трофэктодермы, бластоцисты, анеуплоидии.

Введение
Развитие методов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) позволяет повышать эффективность программ ЭКО/ИКСИ. Все более распространенным дополнением в лечении бесплодия методами ЭКО/ИКСИ становится преимплантационная генетическая диагнос-тика (ПГД), доказавшая свою высокую эффективность. В рамках программы ПГД наибольший удельный вес занимает преимплантационный генетический скрининг (ПГС) анеуплоидий, при котором исследуются количественные хромосомные аномалии у пар с нормальным кариотипом, которые имеют проблемы в лечении бесплодия. Информация, полученная в результате исследований, является важным аргументом селекционного процесса, основанном не только на морфологических, но и генетических характеристиках эмбриона [16,17]. Генетический скрининг анеуплоидий позволяет определить хромосомный статус эмбрионов и выбрать эуплоидные эмбрионы на перенос. Наличие у эмбрионов хромосомной патологии может являться причиной остановки в развитии, так как даже эмбрионы с хорошими морфологическими характеристиками имеют высокий процент хромосомных нарушений [19].

Результат анализа генетического материала после биопсии преимплантационных эмбрионов позволяет получить информацию о моногенных заболеваниях или хромосомных аномалиях, которая помогает отобрать эмбрион с наибольшим имплантационным потенциалом и снизить уровень спонтанных абортов, уменьшить риск рождения детей с генетическими отклонениями, т.е. увеличивает вероятность рождения здорового ребенка [17, 25]. На сегодняшний день опубликовано большое количество исследований, посвященных изучению эффективности ПГС в программах ВРТ. Некоторые авторы указывают на повышение частоты наступления клинической беременности (ЧКБ) при программах ЭКО/ИКСИ с проведением ПГС у пациентов различных возрастных групп [2, 11, 17], а другие исследователи сообщают о снижении эффективности программ [15, 24].

Основной метод, применяемый для определения у эмбрионов «нормального» набора хромосом – флуоресцентная in situ гибридизация (fluorescent in situ hybridization, FISH). Наборы ДНК, используемые для проведения ПГС, сфокусированы на анеуплоидии хромосом, которые наиболее часто выявляются при исследовании спонтанных абортов в I триместре и в аномальных пренатальных образцах. Так как существующие методы исследования 24 хромосом (CGH, array CGH, SNP) достаточно дороги, то применение FISH является привлекательной альтернативой [18].

Биопсия материала для проведения ПГС в зависимости от цели исследования, проводится на различных стадиях: биопсия полярных тел (0 день), биопсия бластомера (3день) и биопсия от 3 до 10 клеток трофэктодермы (TE) на 5-6 день. Хотя проведение биопсии бластомера является наиболее часто используемым методом забора материала [11], установка в лабораториях ЭКО современного и высокотехнологичного оборудования дает возможность проведения биопсии трофэктодермы на стадии бластоцисты. Этот подход дает ряд потенциальных преимуществ над биопсией бластомера: возможность получения при биопсии сразу нескольких клеток для диагностики, снижение рисков потери ядра при фиксации, быстрая регенерация бластоцисты, снижение риска ошибки при анализе и, как следствие, увеличение эффективности метода [2, 19, 20, 25].

Цель исследования
Сравнить эффективность проведения скрининга анеуплоидий методом FISH в циклах ВРТ после биопсии бластомера или трофэктодермы, оценить частоту наступления клинической беременности и частоту имплантации.

Материалы и методы
Были проанализированы программы ПГС, выполненные в Центре «ЭКО» Института Репродуктивной Медицины (ИРМ) г. Алматы с января 2011 по сентябрь 2014 года, на эмбрионах 3-их (I группа, биопсия бластомера) и 5-х суток развития (II группа, биопсия трофэктодермы). В циклах ЭКО/ИКСИ было исследовано 613 эмбрионов на 3 сутки и 768 бластоцист на 5 сутки развития. Показания к проведению ПГС: возраст пациентки более 35 лет; 2 и более неудачные попытки ВРТ в анамнезе; привычное невынашивание – два и более выкидыша или замерших беременностей на ранних сроках в анамнезе; наличие генетических заболеваний у супружеской пары или близких родственников; наличие хромосомных аномалий у плода или в абортивном материале; тяжелый мужской фактор бесплодия; в некоторых случаях – обоснованное желание пациентов.

Индукцию стимуляции суперовуляции проводили по стандартным схемам: длинные и короткие протоколы с агонистами ГнРГ или короткие протоколы с антагонистами ГнРГ, в которых применяли обычные стартовые и курсовые дозы гонадотропинов в соответствии с фолликулярным резервом и возрастными данными. В качестве триггера овуляции назначали хорионический гонадотропин человека (ХГч), рекомбинантный ХГч или аналог гонадотропин-релизинг гормона. Мониторинг развития фолликулов в яичниках проводился путем трансвагинального ультразвукового исследования (УЗИ). Через 36-38 ч после триггера овуляции выполняли трансвагинальную пункцию (ТВП) фолликулов.

Оплодотворение проводилось стандартными методами ЭКО/ИКСИ, через 3±1 ч после ТВП. Культивирование ооцитов/эмбрионов проводилось в течение 5 дней до стадии бластоцисты в инкубаторах SANYO (Japan) и мини-инкубаторах PLANER (UK) в соответствии с рекомендуемыми параметрами для культуральных сред. Для непрерывного мониторинга СО2, рН и Т в инкубаторах использовалась система неинвазивного контроля pH Online™ OCTAX Log&Guard™ (MTG, Germany).

Оценка эмбрионов выполнялась через фиксированные промежутки времени после оплодотворения. Утром 3-го дня оценивали стадию развития эмбрионов и отбирали для проведения биопсии эмбрионы, имеющие не менее шести бластомеров с менее чем 25% фрагментации [7,8]. Для проведения биопсии отбирали бластоцисты, качества не ниже 2ВВ по классификации Gardner [5,6].

При помощи лазерной системы Saturn 5 Active (Reseach Instrument, UK) выполняли биопсию бластомеров и клеток трофэктодермы. Фиксацию ядер на слайде и гибридизацию проводили по стандартной методике с некоторыми модификациями [21]. Для FISH-анализа использовали флуоресцентные зонды Vysis MultiVysion (Abbott Molecular, USA) на 5 хромосом (13, 18, 21, Х, У). Обработку и анализ флюоресцентных меток проводили на микроскопе Olympus BX61 (Japan) в соответствующих фильтрах с использованием программного обеспечения CytoVision® (Leica Biosystems, Germany).

Переносы исследованных эуплоидных эмбрионов в полость матки в I-й группе проводили на 5 сутки, во II-й – на 5 или 6 сутки (первая половина дня), в среде UTM™ (Origio, Denmark). Время от начала проведения биопсии до переноса эмбрионов составляло в среднем от 5 до 6 часов (II группа, биопсия трофэктодермы).

Анализ на ХГЧ проводился на 12-14 день после проведения переноса эмбрионов. При положительном результате (ХГЧ+), через 10 дней проводилось ультразвуковое исследование для визуализации плодного яйца. Результаты исследования оценивались по следующим параметрам: час-тота наступления клинической беременности на перенос, частота имплантации. Достоверность эффектов оценивали с использованием t-критерия для трех степеней свободы при сравнении разности между выборочными долями [1].
Результаты исследования и обсуждение

В исследование были включены пациентки, проходившие лечение бесплодия в центре «ЭКО» ИРМ г. Алматы с применением программ ВРТ в возрасте от 35 до 44 лет. Структура проведенных программ в зависимости от показаний к проведению ПГС представлена на рисунке 1. В результате данного исследования, наибольшую долю в структуре показаний к проведению программ скрининга анеуплоидий методом FISH в циклах ВРТ после биопсии бластомера или трофэктодермы составляют: женщины старшего репродуктивного возраста (35%), с 2 и более неудачными попытками ВРТ в анамнезе (23%) и с привычным невынашиванием (21%).

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРОВЕДЕНИЯ ПРЕИМПЛАНТАЦИОННОГО ГЕНЕТИЧЕСКОГО СКРИНИНГА АНЕУПЛОИДИЙ МЕТОДОМ FLUORESENT IN SITU HYBRIDIZATION (FISH) ПОСЛЕ БИОПСИИ БЛАСТОМЕРА ИЛИ ТРОФЭКТОДЕРМЫ


В соответствии с критериями отбора по качеству развития, биопсия бластомеров и трофэктодермы была проведена у 730 эмбрионов (3-й день) и 768 бластоцист (5-й день), соответственно. Результаты эффективности фиксации ядер на слайде показали, что после проведения биопсии трофэктодермы потери при фиксации отсутствуют, в то время как при фиксации бластомеров потери составили 17%, данные достоверны (табл. 1).

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРОВЕДЕНИЯ ПРЕИМПЛАНТАЦИОННОГО ГЕНЕТИЧЕСКОГО СКРИНИНГА АНЕУПЛОИДИЙ МЕТОДОМ FLUORESENT IN SITU HYBRIDIZATION (FISH) ПОСЛЕ БИОПСИИ БЛАСТОМЕРА ИЛИ ТРОФЭКТОДЕРМЫ


В таблице 2 представлены результаты проведенных программ скрининга анеуплоидий методом FISH в циклах ВРТ после биопсии бластомера (3 день) или трофэктодермы (5 день). Средний возраст пациенток составил 35,9±4,5 и 36,8±3,2 лет в I и II опытных группах, соответственно. В обеих группах среднее число эмбрионов на перенос составило 1,5.

В ходе проведенного исследования количество эуплоидных и анеуплоидных эмбрионов после биопсии бластомера составило 52,7 и 47,3%, и 69,5 и 30,5 % после биопсии трофэктодермы. Результаты анализа эффективности программ ПГС анеуплоидий методом FISH в циклах ВРТ показали, что частота наступления клинической беременности и частота имплантации (7 нед. гестации) в группе после биопсии ТЭ были достоверно выше и составили 60% (68/114) и 42,2% (76/180), соответственно, против 34,5% (37/107) и 23,7% (39/164) в группе после биопсии бластомера.

Высокая ЧКБ (60%) и ЧИ (42,2%) после биопсии троф-эктодермы при проведении ПГС методом FISH в циклах

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРОВЕДЕНИЯ ПРЕИМПЛАНТАЦИОННОГО ГЕНЕТИЧЕСКОГО СКРИНИНГА АНЕУПЛОИДИЙ МЕТОДОМ FLUORESENT IN SITU HYBRIDIZATION (FISH) ПОСЛЕ БИОПСИИ БЛАСТОМЕРА ИЛИ ТРОФЭКТОДЕРМЫ


ВРТ выглядит обнадеживающе, что особенно актуально для женщин старшего репродуктивного возраста, пациенток с многочисленными неэффективными попытками ЭКО/ИКСИ в анамнезе и неудачами имплантации, а это, возможно, позволит увеличить эффективность программ ВРТ [5, 12, 13, 14].
Наши данные также согласуются с результатами исследования, где показано достоверное увеличение ЧКБ в циклах ЭКО/ИКСИ+ПГС после биопсии трофэктодермы (37%) по сравнению с биопсией бластомера (25%). Применение метода биопсии трофэктодермы позволило снизить риск остановки в развитии эмбрионов, получить более достоверные результаты проведенного анализа и значительно увеличить эффективность проводимых программ [15].

При проведении ПГД используют различные методы: биопсия полярных тел, биопсия бластомера на стадии дробления и биопсия трофэктодермы на стадии бластоцисты [9]. Потенциальным преимуществом биопсии трофэктодермы является возможность получения большего количества клеток для анализа, что способствует более точному и качественному проведению генетической диагностики. Опубликованные на сегодняшний день материалы исследований по проведению биопсии трофэктодермы на «свежих» эмбрионах демонстрирует высокую жизнеспособность бластоцист после проведения биопсии, а также высокий уровень частоты наступления клинической беременности (более 40%) и живорождения [19].


При проведении ПГС с использованием биопсии трофэктодермы наблюдаются более высокие показатели по частоте наступления беременности, а также снижение выкидышей и замерших беременностей на ранних сроках [4].
Влияние проведения биопсии на стадии дробления эмбриона на потенциал имплантации в естественных условиях плохо изучены. Современные знания основываются на результатах экспериментов проведенных in vitro [10, 22].

Извлечение клеток при биопсии эмбрионов можно сравнить с потерей клеток после разморозки эмбрионов. Описывается снижение уровня потенциала имплантации в зависимости от количества клеток, взятых при проведении биопсии. Извлечение 25% или большего числа бластомеров является опасным и значительно влияет на потенциал имплантации [3, 23].
Сообщается, что процедура биопсии трофэктодермы не сказывается отрицательно на имплантации и рождении жизнеспособного потомства [20]. Но, несмотря на все преимущества проведения биопсии на эмбрионах 5-х суток развития, все же существуют некоторые ограничения в использовании данного метода. Важными моментами являются стадия развития бластоцисты и ее качество.

В наших исследованиях мы отбирали бластоцисты только отличного и хорошего качества, без фрагментаций и признаков дегенерации, которые потенциально имели высокие шансы к имплантации. Критическую роль играет время проведения генетического анализа и переноса эмбрионов, поскольку важным фактором является «окно имплантации». В стандартных условиях время, затрачиваемое на проведение генетического анализа, занимает от 12 до 24 часов. Подобранные нами условия проведения фиксации ядер, гибридизации и интерпретации результатов дают возможность проводить полный цикл ПГС (биопсия, FISH диагностика и перенос тестированных эмбрионов в полость матки) в максимально короткие сроки от 5 до 6 часов.

Выводы
Сравнительный анализ проведения преимплантационного генетического скрининга анеуплоидий методом FISH после биопсии бластомера (3 день) или трофэктодермы (5 день) свидетельствует о значительном преимуществе трофэктодермальной биопсии с последующим переносом эмбрионов в этот же день. По результатам данной работы, частота наступления клинической беременности и частота имплантации (7 нед. гестации) в группе после биопсии ТЭ были достоверно выше и составили 60 и 42,2% соответственно, против 34,5 и 23,7% в группе после биопсии бластомера.

Проведение биопсии трофэктодермы на стадии бластоцисты – подход с большей эффективностью и преимуществом над методом биопсии бластомера на стадии дробления эмбриона. Применение данного метода позволяет снизить потери ядра при фиксации, способствует быстрой регенерации бластоцисты, поз-воляет снизить риск задержки эмбрионов в развитии, снизить уровень мозаицизма, получить больше материала для проведения анализа с целью постановки более точного диагноза. Биопсия трофэктодермы дает возможности для проведения ПГС анеуплоидий методом FISH на замороженных бластоцистах, что может являться одним из способов повышения эффективности циклов ВРТ. Таким образом, применение в программах ПГД менее травматичных методик при биопсии эмбрионов с высокой вероятностью постановки точного диагноза способствует лучшей выживаемости эмбрионов и их дальнейшему развитию с последующей имплантацией.

Подбор условий для проведения ПГС анеуплоидий методом FISH с проведением биопсии трофэктодермы на стадии бластоцисты позволяет в максимально короткие сроки осуществлять отбор эмбрионов без хромосомной патологии для их селективного переноса в полость матки, что наиболее актуально для возрастных пациентов, а также тех, кто сталкивается с генетическими нарушениями у плода, замершими беременностями и многочисленными неудачными попытками ЭКО/ИКСИ в анамнезе.

ЛИТЕРАТУРА:
Плохинский Н.А. Биометрия. Новосибирск: СО АН СССР 1961; 364
de Boer K.A., Catt J.W., Jansen R.P., Leigh D., McArthur S. Moving to blastocyst biopsy for preimplantation genetic diagnosis and single embryo transfer at sydney IVF. Fertil. Steril. 2004; 82:p. 295-298
Cohen J., Wells D., Munneґ S. Removal of 2 cells from cleavage stage embryos is likely to reduce the efficacy of chromosomal tests that are used to enhance implantation rates. Fertil. Steril. 2007; 87:р. 496-503
Forman E.J., Tao X., Kerry K.M., Taylor D., Treff N.R., Scott R.T., Jr. Single embryo transfer with comprehensive chromosome screening results in improved ongoing pregnancy rates and decreased miscarriage rates. Hum Reprod. 2012; 27:р. 1217-1222
Gardner D.K., Schoolcraft W.B. In vitro culture of human blastocysts. Fertility and Genetics Beyond. 1999; 2:р. 378-388
Gardner D.K., Lane M., Stevens J., Schlenker T., Schoolcraft W.B. Blastocyst score affects implantation and pregnancy outcome: towards a single blastocyst transfer. Fertil. Steril. 2000; 73:р. 1155-1158
Goossens V. et al. Diagnostic efficiency, embryonic development and clinical outcome after the biopsy of one or to blastomeres for preimplantation genetic diagnosis. Hum Reprod. 2008; 23:р. 481-492
Joris H. et al. Comparison of the results of human embryo biopsy and outcome of PGD after zona drilling using acid Tyrode medium or a laser. Hum Reprod. 2003; 18:р. 1896-1902
Treff N.R. et al. Development and validation of an accurate quantitative real-time polymerase chain reaction-based assay for human blastocysts comprehensive chromosomal aneuploidy screening. Fertil. Steril. 2012; 97:p. 819-824
Hardy K., Martin K., Leese H., Winston R., Handyside A. Human preimplantation development in vitro is not adversely affected by biopsy at the 8-cell stage. Hum Reprod. 1990; 5:р. 708-714
Harper J.C. et al. ESHRE PGD consortium data collection VII: cycles from January to December 2004 with pregnancy follow-up to October 2005. Hum Reprod. 2008; 23:р. 741-755
Lathi R.B., Behr B. Pregnancy after trophectoderm biopsy of frozen-thawed blastocyst. Fertil. Steril. 2009; 91:p. 1938-194
Lyerly A.D. et al. Fertility patients’ views about frozenembryo disposition: results of a multi-institutional U.S. survey. Fertil. Steril. 2010; 93:p. 499-509
Rubio C. et al. Chromosomal abnormalities and embryo development in recurrent miscarriage couples. Hum Reprod. 2003; 18:p. 182-188
Mastenbroek S. et al. In vitro fertilization with preimplantation genetic screening. New England Journal of Medicine. 2007; 357:р. 9-17
Munne S. et al. Spontaneous abortions are reduced after preconception of translocations. J Ass Reprod Genet 1998; 15(5):p. 290-296
Munne S. et al. Positive outcome after preimplantation diagnosis of aneuploidy in human embryos. Hum Reprod 1999; 14:p. 2191-2199
Munné S. et al. Improved detection of aneuploid blastocysts using a new 12-chromosome FISH test. Reprod Biomed Online. 2010; 20:р. 92-97
McArthur S.J. et al. Pregnancies and live births after trophectoderm biopsy and preimplantation genetic testing of human blastocysts. Fertil. Steril. 2005; 84:p. 1628-1636
Scott R.T. et al. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertil. Steril. 2013; 100:р. 624-630
Tarkowsky A.K. An air drying method for chromosome preparation from mouse eggs. Cytogenetic. 1964: 5:р. 394-400
Tarin J.J., Conaghan J., Winston R.ML., Handyside A.H. Human embryo biopsy on the 2nd day after insemination for preimplantation diagnosis: removal of a quarter of embryo retards cleavage. Fertil. Steril. 1992; 58:р. 970-976
Tang R., Catt J., Howlett D. Towards defining parameters for a successful single embryos transfer in frozen cycles. Hum Reprod. 2006; 21:р. 1179-1183
Twisk M. et al. Preimplantation genetic screening for abnormal number of chromosomes (aneuploidies) in vitro fertilisation or intracytoplasmic sperm injection. Cochrane Database Syst Rev. 2006; 1:р. 1105
Simpson J.L. Preimplantation genetic diagnosis at 20 years. Prenat. Diagn. 2010; 30:p. 682-695




 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  .  
 

Copyright (C) Репродуктивная медицина. Научно-практический журнал
г. Алматы, Алмалинский район, ул. Байтурсынова 79.
Тел.: +7 (727) 250 00 11, skype: medmedia.kz, e-mail: info@medmedia.kz
   
 
Яндекс.Метрика