ГЛАВНАЯ ЖУРНАЛЫ СОБЫТИЯ ИЗДАНИЯ КОНГРЕСС О НАС КОНТАКТЫ  

ДИАГНОСТИКА «МИНИМАЛЬНОГО» МОЗАИЦИЗМА ПОЛОВЫХ ХРОМОСОМ С ПРИМЕНЕНИЕМ ФЛЮОРЕСЦЕНТНОЙ IN SITU ГИБРИДИЗАЦИИ У СУПРУЖЕСКИХ ПАР С ПРОБЛЕМАМИ РЕПРОДУКЦИИ
 

В.В. Ладыгина, В.В. Чистяков, А.Е.Чистякова

 

Институт репродуктивной медицины, г. Алматы

 

Резюме. В работе показано значение и эффективность FISH-диагностики для выявления «минимального» мозаицизма у супружеских пар с нарушениями репродуктивной функции. 

 

Актуальность темы. В последнее время появляется все больше работ, указывающих на связь минимального мозаицизма с клиническими проявлениями хромосомных синдромов [1-4]. Ворсанова С.Г. с соавторами показывают корреляцию мозаицизма с мужским бесплодием, обусловленным азооспермией или тяжелой олигозооспермией [5, 6, 14, 16]. Кирилова Е.А. Meschede D, Krishna Murthy D. приводят данные о том, что у женщин старше 38 лет частота встречаемости мозаицизма гоносом возрастает [7, 12, 13]. В своих работах Bielanska M., Coonen E. показали низкий процент имплантации эмбрионов у женщин с минимальным мозаицизмом Х хромосомы [8, 11].
Достижения современной медицинской генетики позволяют внедрять новые высокоэффективные методы в диагностику хромосомных патологий. Однако, несмотря на это, проблемы, связанные с изучением мозаичных форм численных аномалий хромосом, остаются актуальными [9, 10, 17]. Кариотипирование как рутинная цитогенетическая методика эффективна при численных и структурных аномалиях. Однако, мозаичные формы хромосомной патологии, особенно с низким уровнем анеуплоидного клона, сложны для выявления данным классическим методом. Незначительный клон аномальных клеток может быть не выявлен при цитогенетическом анализе. Зачастую обнаружение одной анеуплоидной клетки при проведении кариотипирования воспринимается, как артефакт и не констатируется в цитогенетическом заключении. Критерии подсчета и анализа метафазных пластин в литературных источниках представлены различными нормативами и варьируют от 20 до 100 [5, 18]. Не редко рекомендации становятся не выполнимыми из-за ограничений и трудоемкости метода, что в свою очередь затрудняет установления истинного генетического диагноза. При использовании флюоресцентной in situ гибридизации (FISH) возможен подсчет и анализ 200-1000 интерфазных ядер. Данное преимущество позволяет точно установить наличие или отсутствие анеуплоидных клеток и выявить их истинное соотношение [19].

Материалы и методы. В 2010-11 гг. по результатам кариотипирования было выявлено 28 пациентов, с подозрением на «минимальный» мозаицизм половых хромосом, из них 17 женщин 11 мужчин. При цитогенетическом исследовании использовались стандартные методики 72-часового культивирования лимфоцитов. Все этапы работы проводились с использованием реактивов фирмы «Gibco». Подготовка, фиксация и дифференциальное (GTG) окрашивание хромосом проводи по методике, рекомендованной специалистами Kaplan Medical Center (Израиль). При проведении кариотипирования, в случае обнаружения хотя бы 1 анеуплоидной клетки анализировалось 30 метафазных пластин. В данной группе для установления истинного мозаицизма проводилась последующая FISH-диагностика ядер лимфоцитов. Для флюоресцентной гибридизации in situ использовали центромерные зонды фирмы Vysis на хромосомы Х и Y. Гибридизацию in situ проводили в соответствии с протоколом, рекомендованным фирмой-производителем. Количество проанализированных интерфазных ядер составляло 200-500. Исследования проводилось на микроскопе OLYMPUS BX 61 с программным обеспечением Applied Imaging.

Результаты и их обсуждения. Всего цитогенетическое исследование проведено 525 пациентам (257 – мужчин и 268 – женщин). С подозрением на мозаицизм гоносом было обследовано 28 пациентов, что составило 5,3% от общего числа. Следует отметить, что в общей популяции процент численных хромосомных патологий составляет 0,43% [20]. Все обследованные пациенты имели различные проблемы репродукции. В таблице 1 указаны показания для кариотипирования и процент подтвержденных случаев мозаицизма после проведения FISH-анализа.

Таблица 1. Взаимосвязь «минимального» мозаицизма и проблемы бесплодия

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

В таблицах 2 и 3 представлены результаты цитогенетического и молекулярно-цитогенетического исследований мужчин и женщин, с подозрением на мозаицизм гоносом. Во всех случаях при кариотипировании выявлены 1 или 2 клетки с анеуплоидией по Х или Y хромосоме из 30 проанализированных. 
При кариотипировании у мужчин обнаружено 11 (4,2%) случаев с единичными анеуплоидными клетками, из них в 4 случаях с дисомией по Х хромосоме (47,ХХY/46,XY), в 6 случаях с моносомией по гоносомам (45,X/46,XY) и в одном случае кариотип 45,X/47,XXY/46,XY. После проведения FISH-диагностики ядер лимфоцитов, у 5 (45,4%) пациентов мозаицизм был подтвержден. Показано, что во всех случаях процент патологичного клона был больше, чем при кариотипировании и в среднем составил 7,2% против 3,8% соответственно. Также замечено, что в тех случаях, где была обнаружена одна клетка с потерей Y хромосомы, при проведении FISH-диагностики мозаицизм не подтверждался. Можно сделать предположение, что из-за небольшого размера и молекулярной массы Y хромосомы, может происходить ее «механическая потеря». В тоже время, как видно из таблицы 2, при обнаружении двух клеток с кариотипом 45,X у обоих пациентов мозаицизм подтвердился.

 
Таблица 2. Результаты кариотипирования и FISH-диагностики у обследованных мужчин

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

* в скобках указаны проценты патологичных клонов, выявленных при FISH-диагностики для каждого конкретного случая.

Из 268 обследованных женщин у 17 при кариотипировании обнаружены анеуплоидные клетки по гоносомам. Проведенная FISH-диагностика подтвердила наличие патологичных клонов клеток с анеуплоидиями гоносом у 10 пациенток, что составило 58,8% от 17 обследованных. Из 7 случаев с выявленной трисомией, по результатам FISH- анализа в пяти было сделано заключение о наличии мозаицизма по половым хромосомам. В группе пациентов с моносомией по Х хромосоме мозаичный кариотип подтвердился у 3 из 8 случаях. Две пациентки, у которых кариотип был определен как 45,X[1]/47,XXX[1]/46,XX[27] получили генетическое заключение, подтверждающее мозаицизм.

 

Таблица 3. Результаты кариотипирования и FISH-анализа у обследованных женщин

  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

* в скобках указаны проценты патологичных клонов, выявленных при FISH-диагностики для каждого конкретного случая.

Таким образом, из 28 пациентов с подозрением на мозаицизм в 15 случаях результат анализ был подтвержден, что составило 53,5%. Как видно из таблиц 2 и 3, у женщин мозаичные формы анеуплоидии гоносом подтверждаются чаще, чем у мужчин, и составляют соответственно 58,8% и 45,4%. Можно сделать предположение, что в данном случае фактором, повышающим процент мозаицизма, является возраст. Интересно отметить, что средний возраст пациенток с показаниями для проведения FISH- диагностики лимфоцитов крови, в нашем исследовании составил 37,5 лет, что выше среднего возраста общей группы обследованных женщин (32,6 лет). Данные факты подтверждаются литературными источниками. [7,12,13] Возраст обследованных мужчин остался в пределах средних значений и составил 34, 6 лет. Следует отметить, что все мужчины, вошедшие в группу, исследования имели те или иные нарушения сперматогенеза. Из чего можно сделать предположения, что даже минимальный процент клеток с дисомией Х хромосомы или моносомией по гоносомам может приводить к нарушениям репродуктивной функции.

Выводы:
1. Частота встречаемости численных хромосомных патологий в группе пациентов с проблемами репродукции значительно выше (5,3%), чем в общей популяции (0,43%)
2. «Минимальный» мозаицизм у женщин встречается чаще, чем у мужчин, что возможно сопряжено с увеличением нестабильности Х хромосомы с возрастом женщины.
3. Опираясь на литературные источники и полученные данные, можно сделать вывод, о том, что даже незначительное присутствие анеуплоидного клона клеток коррелирует с нарушениями сперматогенеза у мужчин.
4. Высокий процент подтверждения мозаицизма (53,5%) молекулярно-цитогенетическим методом на интерфазных ядрах показывает целесообразность использования FISH метода для выявления хромосомной патологии в группе с отягощенным репродуктивным анамнезом.

 

ЛИТЕРАТУРА

1. Ворсанова С.Г., Бедельбаева К.А., Никишин В.А., Доронин Г.Л., Демидова И.А. Пренатальная диагностика синдрома Эдвардса: мозаичный случай заболевания. // Вопр охр мат и дет, 1982.-8.-70-71.
2. Ворсанова С.Г., Юров Ю.Б., Александров И.А., Демидова И.А., Миткевич С.П., Доронин Л.Г. Молекулярно-цитогенетическая диагностика наследственных болезней, связанных с различными аномалиями хромосом X. // Педиатрия, 1989.-1.-76-80.
3. Ворсанова С.Г., Юров Ю.Б., Дерягин Г.В., Соловьев И.В., Бытемская Г.А. К методике диагностики анеуплоидий при помощи гибридизации in situ: анализ интерфазных ядер. // Бюлл экспер биол мед, 1991.-10.-413-415.
4. Ворсанова С.Г., Берешева А.К., Казанцева JI.3., Демидова И.А., Шаронин В.О., Соловьев И.В., Юров Ю.Б. Молекулярно-цитогенетическая диагностика хромосомных аномалий у супружеских пар с нарушением репродуктивной функции. // Пробл репрод, 1998а.-4.-41-46.
5. Ворсанова С.Г., Юров Ю.Б., Чернышов В.Н. Хромосомные синдромы и аномалии. Классификация и номенклатура. // Ростов-на-Дону. Молот. - 1999. -192с.
6. Ворсанова С.Г., Юров Ю.Б., Чернышов В.Н. Медицинская цитогенетика (учебное пособие). // М. МЕДПРАКТИКА-М, 2006,- 300с.
7. Кириллова Е.А., Никифорова O.K., Жученко H.A., Побединский Н.М., Красников Д.Г. Мониторинг врожденных пороков развития у новорожденных. // Рос вест перинат педиатр, 2000.-1.-18-21.
8. Bielanska M., Tan S.L., Ao A. Chromosomal mosaicism throughout human preimplantation development in vitro: incidence, type, and relevance to embryo outcome. // Hum Reprod, 2002.-17.- 2,- 413-419.
9. Юров И.Ю., Ворсанова С.Г., Юров Ю.Б. Современные достижения в молекулярно-цитогенетической диагностике наследственных болезней. // Клин лаб диагн, 2005,- 11.-21-29
10. Eiben B., Trawicki W., Hammans W., Gocbel R., Pruggmaycr M., Epplen J.T. Rapid prenatal diagnosis of aneuploidies in uncultured amniocytes by fluorescence in situ hybridization. Evaluation of >3,000 cases. // Fetal Diagn Ther, 1999.-14(4).-193-197.
11. Coonen E., Hopman A., Geraedts J., Ramaekers F. Application of in-situ hybridization techniques to study human preimplantation embryos: a review. Hum Reprod Update 1998; 4: 135-52.
12. Meschede D., Lemcke B., Exeler J. et al. Chromosome abnormalities in 447 couples undergoing intracytoplasmic sperm injection -prevalence, types, sex distribution and reproductive relevance. Hum Reprod 1998; 13: 576-82.
13. Krishna Murthy D., Farag T. Reccurent regular trisomy-21 in two Bedouin families. Parental mosaicism versus genetic predisposition. Ann Genet 1995; 38: 217—24.
14. Peschka B., Leygraaf J., van der Ven K. et al.. Type and frequency of chromosome aberrations in 781 couples undergoing intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod 1999; 14: 2257-63.
15. Gekas J., Thepot F., Turleau C. et al. Chromosomal factors of infertility in candidate couples for ICSI: an equal risk of constitutional aberrations in women and men. Hum Reprod 2001; 16: 82-90.
16. van der Ven K., Peschka B., Montag M. et al. Increased frequency of congenital chromosomal aberrations in female partners of couples undergoing intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod 1998; 13: 48-54.
17. Youssoufian H., Pyeritz R. Mechanisms and consequences of somatic mosaicism in humans. Nature 2002; 3: 748-58.
18. Bond D.C., Chandley A.C. Aneuploidy. // Oxford. Monographs on Medical Genetics., Oxford University Press, 1983.- 11. – 198 p.
19. Abdelmoula N.B., Amouri A., Portnoi M. Cytogenetics and fluorescence in situ hybridization
20. Баронов В.С., Кузнецова Т.В. «Цитогенетика эмбрионального развития человека», 2007 г. 





 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  .  
 

Copyright (C) Репродуктивная медицина. Научно-практический журнал
г. Алматы, Алмалинский район, ул. Байтурсынова 79.
Тел.: +7 (727) 250 00 11, skype: medmedia.kz, e-mail: info@medmedia.kz
   
 
Яндекс.Метрика