ВВЕДЕНИЕ
Успехи современной репродуктивной медицины основаны на достижениях в области искусственного оплодотворения, криобиологии и криомедицины последних нескольких десятилетий. Криоконсервация клеток, тканей и органов подразумевает под собой низкотемпературное хранение живых биологических объектов с возможностью восстановления их биологических функций после размораживания [1]. Современные методы криоконсервации позволяют сохранить потенциал гамет, эмбрионов и репродуктивных тканей (яичниковая ткань и тестикулярная ткань) человека, что представляет собой значительный практический интерес. Ряд исследовательских работ фундаментального характера, посвященных криоконсервации биологических объектов, показали разную степень их выживаемости, связанную с рядом факторов [2]. Разработка и совершенствование методов криоконсервации явилось новым этапом в развитии вспомогательных репродуктивных технологий, при этом особое внимание заслуживает возможность замораживания эмбрионов [3].
К преимуществам, которые появились благодаря разработке методов криоконсервации, можно отнести: уменьшение количества переносов свежих эмбрионов с максимальным повышением эффективности цикла ЭКО. Точно так же замораживание эмбрионов является важным методом в случаях отмены переноса эмбрионов из-за риска гиперстимуляции яичников, повышенного уровня прогестерона в сыворотке крови в день переноса, отсутствие роста эндометрия или любых других незапланированных событий. В случае криоконсервации эмбрионов, которые можно замораживать начиная со стадии зиготы, основным критерием для отбора является качество [4]. Однако наибольшую эффективность криопрограмм показала криоконсервация на стадии бластоцисты [5].
Замораживание эмбрионов отличного и хорошего качества позволяет сохранить репродуктивный потенциал для пациентов в будущем и достичь наступления беременности, используя один цикл стимуляции [6].
Витрификация как метод криоконсервации комбинирует использование высококонцентрированных растворов криопротекторов и быстрого (практически мгновенного) охлаждения путем погружения образцов непосредственно в жидкий азот. За счет этого достигается главная цель витрификации – отсутствие формирования кристаллов льда, которые могут повредить структуры клетки.
Витрификация – это физический процесс, при котором высококонцентрированные растворы криопротекторов в процессе быстрого охлаждения приобретают аморфное стекловидное состояние. Молекулярная и ионная структура, характерная для жидкой фазы, позволяет считать стекловидное состояние экстремально вязкой суперохлажденной жидкостью [5].
Основные преимущества витрификации заключаются в следующем: высокая концентрация криопротекторов и высокая скорость охлаждения/оттаивания исключают повреждения, вызванные образованием внутриклеточного льда, а также нежелательные осмотические эффекты дегидратации и регидратации вследствие внеклеточного кристаллообразования.
Основным критериям эффективности работы системы витрификации является выживаемость эмбрионов. Соответственно данным Венского консенсуса (The Vienna consensus: report of an expert meeting on the development of ART laboratory performance indicators, 2017) выживаемость бластоцист (эмбрионов 5-6-х суток преимплантационного развития) составляет 90% и более [7,8].
Целью данной работы была оценка выживаемости бластоцист человека в зависимости от стадии развития и определить их имплантационный потенциал в криопротоколах.
Материалы и методы исследования
Изучение выживаемости эмбрионов было проведено в рамках циклов экстракорпорального оплодотворения на базе эмбриологических лабораторий ЗАО «Медицинская компания ИДК». Использование в научных исследованиях половых клеток и эмбрионов человека было разрешено этическим комитетом ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России.
Эмбрионы были идентифицированы под контролем стереомикроскопа (Nicon, Япония). Для инкубации использованы инкубаторы СООК (Австралия). Для культивирования эмбрионов до 5-6-х суток эмбрионального развития были использованы среды Vitrolife (Швеция). Для витрификации эмбрионов были использованы среды Irvine Scientific (США), носители открытого CryoTop (Япония) и закрытого CryoTip (США) типов. Бластоцисты 5-6-х суток культивирования оценивали по международной классификации (D.K. Gardner et al., 1999) [9]. В основе которой лежит оценка трех основных параметров: степень экспансии (увеличения бластоцисты), выраженность внутриклеточной массы (ВКМ) и степень развития трофэктодермы (ТЭ). В ходе работы для упрощения оценки качества эмбрионов с учетом классификации Гарднера предложена и внедрена в рутинную практику лаборатории ВРТ Медицинской компании ИДК система оценки качества эмбрионов эмбрионов (таблица 1).
Таблица 1 — Система оценки качества эмбрионов 5-6-х суток развития
Оценка качества эмбриона | Стадия развития (D.K. Gardner et all, 2000) |
Эмбрион отличного качества | Бластоциста категории АА, АB, BA, BB, 3,4,5 степени экспансии |
Эмбрион хорошего качества | Бластоциста категории BC, CB, CA, AC, 3,4,5 степени экспансии, ранняя бластоциста, начало кавитации без вакуолей и фрагментации |
Эмбрион удовлетворительного качества | Бластоциста категории CC, 3,4,5 степени экспансии, ранняя бластоциста, начало кавитации с вакуолями или фрагментацией |
Эмбрион посредственного качества | Морула, начало кавитации с вакуолями и фрагментацией |
Морфологическую оценку жизнеспособности эмбрионов на стадии бластоцисты оценивали через 1-2 часа после размораживания, это время необходимо для восстановления бластоцисты. Если эмбрион имеет более 50% неповрежденных клеток, то он считается жизнеспособным.
Статистическую обработку данных выполняли на компьютере с помощью электронных таблиц «Microsoft Exel» и пакета статистических программ «Statistica V 10» (США), SPSS Statistics 22 (США) и «SAS V8».
Результаты исследования
Всего было проанализировано 1406 эмбрионов на разных стадиях развития. Проведенный анализ зависимости выживаемости эмбрионов от стадии развития показал, что диапазон выживаемости эмбрионов в разных группах составил от 75 до 100%. Суммарные данные представлены в виде Таблицы 2. Следует отметить, что самый низкий уровень выживаемости демонстрируют эмбрионы 6 степени экспансии, а именно вылупившиеся бластоцисты, при этом в более многочисленных группах (более 100 случаев) выживаемость составила более 95%, что свидетельствует о высокой степени криотолерантности эмбрионов отличного и хорошего качества. Низкие, по сравнению с другими группами, показатели выживаемости у эмбрионов со степенью экспансии 6, возможно, связаны с отсутствием у этих эмбрионов оболочки оплодотворения и цитотоксичным влиянием криопротекторов на клетки трофэктодермы. Количество эмбрионов в этой группе крайне мало, чтобы сделать какие-либо однозначные выводы по данному поводу.
Таблица 2 — Выживаемость эмбрионов в зависимости от стадии развития эмбрионов
Стадия развития эмбриона | Степень развития ВКМ | Степень развития трофэктодермы | Количество эмбрионов | Выживаемость,% | |
1 | 0.морула | <NA> | <NA> | 5 | 100.00 |
2 | 1.нач.кав | <NA> | <NA> | 156 | 90.33 |
3 | 2.ран.бласт | A.вкм1 | A.тэ1 | 1 | 100.00 |
4 | 2.ран.бласт | <NA> | <NA> | 187 | 90.00 |
5 | 3.бласт | A.вкм1 | A.тэ1 | 41 | 100.00 |
6 | 3.бласт | A.вкм1 | B.тэ1 | 109 | 95.51 |
7 | 3.бласт | A.вкм1 | C.тэ1 | 3 | 100.00 |
8 | 3.бласт | B.вкм1 | A.тэ1 | 8 | 100.00 |
9 | 3.бласт | B.вкм1 | B.тэ1 | 141 | 89.33 |
10 | 3.бласт | B.вкм1 | C.тэ1 | 27 | 92.16 |
11 | 3.бласт | C.вкм1 | C.тэ1 | 2 | 100.00 |
12 | 3.бласт | <NA> | <NA> | 1 | NA |
13 | 4.бласт | A.вкм1 | A.тэ1 | 193 | 96.96 |
14 | 4.бласт | A.вкм1 | B.тэ1 | 168 | 97.90 |
15 | 4.бласт | A.вкм1 | C.тэ1 | 1 | 100.00 |
16 | 4.бласт | A.вкм1 | <NA> | 1 | 100.00 |
17 | 4.бласт | B.вкм1 | A.тэ1 | 21 | 100.00 |
18 | 4.бласт | B.вкм1 | B.тэ1 | 107 | 97.21 |
19 | 4.бласт | B.вкм1 | C.тэ1 | 13 | 100.00 |
20 | 4.бласт | C.вкм1 | B.тэ1 | 1 | 100.00 |
21 | 4.бласт | C.вкм1 | C.тэ1 | 1 | 100.00 |
22 | 4.бласт | <NA> | <NA> | 1 | 100.00 |
23 | 5.бласт | A.вкм1 | A.тэ1 | 43 | 96.43 |
24 | 5.бласт | A.вкм1 | B.тэ1 | 15 | 100.00 |
25 | 5.бласт | B.вкм1 | A.тэ1 | 7 | 100.00 |
26 | 5.бласт | B.вкм1 | B.тэ1 | 8 | 81.82 |
27 | 6.бласт | A.вкм1 | A.тэ1 | 5 | 100.00 |
28 | 6.бласт | A.вкм1 | B.тэ1 | 4 | 75.00 |
29 | 6.бласт | B.вкм1 | B.тэ1 | 3 | 100.00 |
30 | <NA> | <NA> | <NA> | 133 | 37.68 |
31 | Итого | 1406 | 94.49 |
Был проведен детальный анализ зависимости частоты наступления беременности от стадии замороженной бластоцисты (степени экспансии, выраженности внутриклеточной массы (ВКМ) и трофэктодермы (ТЭ).
Относительно такого признака, как степень экспансии, было показано, что показатели частоты наступления беременности (ЧНБ) – положительное УЗИ – возрастают с увеличением степени экспансии от стадии начала кавитации бластоцисты до увеличенной бластоцисты (степень экспансии 4), достигая максимума у вылупленных бластоцист, лишенных оболочки оплодотворения. Подобная тенденция является вполне закономерной: эмбрион с более высоким уровнем организации и клеточной дифференцировкой дает более высокие показатели ЧНБ. Однако, обращает на себя внимание снижение показателей в группе бластоцист со степенью экспансии 5, это эмбрионы, которые находились при замораживании в состоянии хетчинга (вылупления). По всей вероятности, эмбрионы данной стадии развития являются наиболее уязвимыми к воздействию процедуры замораживания. Результаты зависимости ЧНБ от степени развития размороженных эмбрионов представлена в Таблице 3.
Таблица 3 —
Распределение положительных (да) и отрицательных (нет) УЗИ по стадиям развития. | ||||
УЗИ | ||||
о.ст.1 | да | нет | Общее число | |
0.морула | N | 1 | 4 | 5 |
% стр. | 20.0 % | 80.0 % | ||
1.нач.кав | N | 33 | 122 | 155 |
% стр. | 21.3 % | 78.7 % | ||
2.ран.бласт | N | 61 | 127 | 188 |
% стр. | 32.4 % | 67.6 % | ||
3.бласт | N | 147 | 182 | 329 |
% стр. | 44.7 % | 55.3 % | ||
4.бласт | N | 251 | 255 | 506 |
% стр. | 49.6 % | 50.4 % | ||
5.бласт | N | 27 | 45 | 72 |
% стр. | 37.5 % | 62.5 % | ||
6.бласт | N | 8 | 4 | 12 |
% стр. | 66.7 % | 33.3 % | ||
Общее число | N | 528 | 739 | 1267 |
% стр. | 41.7 % | 58.3 % |
Различие в доле положительных УЗИ значимо различалось между стадиями (p <0.01), т.е % положительных УЗИ рос от морулы (20.0%) до 6.бласт(66,7%) с небольшим «провалом» на стадии экспандированных (5) бластоцист ( 37,5%).
Проводя сравнительный анализ по следующему признаку – степени развития ВКМ, мы получили ожидаемые результаты: чем выше степень компактизации клеток в ВКМ, тем более высокие показатели ЧНБ. У бластоцист с ВКМ А (581 эмбрион) показатель ЧНБ составил 51,3%, у бластоцист с ВКМ В (334 эмбриона) – 39,8%. Различия значимы при уровне p=0,004. Результаты анализа представлены в Таблице 4.
Следует обратить внимание, что в группе бластоцист с внутриклеточной массой С (клеток крайне мало или она отсутствует), мы получили 50% ЧНБ. Этот показатель вряд ли можно признать объективным вследствие крайне малочисленной группы (4 эмбриона), поскольку эмбрионы с подобной морфологией, как правило, не подлежат замораживанию.
Таблица 4 –
Распределение положительных (да) и отрицательных (нет) УЗИ по ВКМ. | ||||
УЗИ | ||||
о.вкм.1 | да | нет | Общее число | |
A | N | 298 | 283 | 581 |
% стр. | 51.3 % | 48.7 % | ||
B | N | 133 | 201 | 334 |
% стр. | 39.8 % | 60.2 % | ||
C | N | 2 | 2 | 4 |
% стр. | 50.0 % | 50.0 % | ||
Общее число | N | 433 | 486 | 919 |
% стр. | 47.1 % | 52.9 % |
Выраженность трофэктодермы, степень развития которой является наиболее значимой в процессе имплантации, напрямую коррелирует с данными ЧНБ.
При анализе 918 эмбрионов (таблица 5) мы получили, что бластоцисты с трофэктодермой класса А (318) дают наиболее показатели – 57,5% ЧНБ, бластоцисты с трофэктодермой класса В (553) – 42,9% ЧНБ, с трофэктодермой класса С – 27,7% ЧНБ. Эти различия достоверны при уровне значимости p < 0,01.
Таблица 5 —
Распределение положительных (да) и отрицательных (нет) УЗИ по ТЭ. | ||||
УЗИ | ||||
о.тэ.1 | да | нет | Общее число | |
A | N | 183 | 135 | 318 |
% стр. | 57.5 % | 42.5 % | ||
B | N | 237 | 316 | 553 |
% стр. | 42.9 % | 57.1 % | ||
C | N | 13 | 34 | 47 |
% стр. | 27.7 % | 72.3 % | ||
Общее число | N | 433 | 485 | 918 |
% стр. | 47.2 % | 52.8 % |
Обсуждение результатов
Таким образом, проводя сравнительный статистический анализ, было выявлено влияние всех компонентов оценки бластоцист – стадии, степени развития ВКМ и выраженности трофэктодермы на степень выживаемости и уровень частоты наступления беременности. Эмбрионы с наиболее высоким уровнем развития внутриклеточной массы А и трофэктодермы А дают наиболее высокие результаты. Неожиданными получены результаты по ЧНБ в группе эмбрионов с внутриклеточной массой С (50%), вряд ли их можно считать закономерными с учетом малого количества случаев (4). Степень экспансии бластоцист также показывает прямую связь с ЧНБ, исключением являются бластоцисты 5 стадии преимплантационного развития (бластоцисты с хетчингом). По свей вероятности, этот энергетически активный процесс для эмбриона (когда эмбрион экспандирует через определенные промежутки времени) крайне важен. Эмбрион пытается найти наиболее благоприятное место для разрыва оболочки оплодотворения и выхода из нее. По сути, эта стадия развития является своеобразным критическим периодом развития для эмбриона. Соответственно, в этот момент, он представляется наиболее уязвимым для воздействия внутренних и внешних факторов. Витрификация определенным образом в этот момент и является тем самым внешним фактором, который определяет более низкие показатели ЧНБ у эмбрионов данной стадии развития.
Выводы
- Морфологическая
оценка эмбрионов является определяющей в успехе их витрификации
- Степень экспансии, выраженность внутриклеточной массы и степень развития трофэктодермы эмбрионов человека влияют на уровень выживаемости и частоту наступления беременности
- Витрификация эмбрионов может быть использована для резервации их биологической компетенции и применяться как эффективный инструмент для сохранения их репродуктивного потенциала.
Список литературы
- Mazur P. Science. 1970; 168: 939-949.
- Cobo A., García-Velasco J.A., Coello A., Domingo J., Pellicer A, Remohí J. Fertil Steril. 2016; 105(3): 755-764
- Pegg D.E. Semin. Reprod. Med. 2002; 20 (1): 5-13.
- Pegg D., Kleinhans F. Cryobiology 2016; 72(2): 83-85.
- Mukaida, T., Oka C. Best Pract.Res.Clin.Obstet.Gynaecol. 2012; 26 (6): 789-803.
- Roque M. J. Assist Reprod Genet. 2015; 32: 171-176.
- Sciorio R. Thong K.J., Pickering S.J. Cryobiology. 2018; 84: 40-45.
- Kuwayama M. Theriogenology. 2007; 67(1):73–80.
- Gardner D.K., Schoolcraft W.B. Toward Repr.Certainty: Fert. and Gen. Beyond. 1999; 378–388.